Exercices - clonage moléculaire Flashcards

1
Q

Qu’est-ce que le clonage moléculaire?

A

L’amplification d’un fragment d’ADN par des microorganismes après son insertion dans un vecteur.

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Q

Quelles sont les grandes étapes pour la production d’un ADN recombinant?

A

Extraction des plasmides bactériens
Ouverture du plasmide par une enzyme de restriction
Extraction ou synthèse du gène ou de l’ADN d’intérêt
Ligation de l’ADN d’intérêt avec le plasmide ouvert
Réintroduction des plasmides dans des bactéries
Reproduction de l’ADN d’intérêt par la bactérie

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3
Q

Qu’est-ce qu’un plasmide?

A

Fragment d’ADN double brin, le plus souvent circulaire, que l’on retrouve dans le cytoplasme des bactéries ou levures. Il n’est pas indispensable à la cellule, mais lui confère différentes propriétés.

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4
Q

Quelles sont les principales caractéristiques du plasmide?

A

Circulaire
Double-brin
Présent dans le cytoplasme de plusieurs espèces bactériennes
Réplication autonome
Présence de divers gènes (résistance aux antibiotiques, métaux lourds)

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5
Q

À quoi sert un vecteur?

A

Il sert de transporteur.

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6
Q

En quoi le plasmide est-il un vecteur?

A

Il peut transporter des fragments d’ADN.

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7
Q

Quels sont les constituants essentiels d’un vecteur de clonage?

A

L’origine de réplication
Un gène de sélection
Site de clonage multiple

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8
Q

En quoi l’origine de réplication est-elle essentielle au plasmide?

A

Elle permet la réplication autonome et l’amplification du nombre de copies du vecteur.

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9
Q

Comment le gène de la bêta-lactamase peut-il être utilisé comme gène de sélection dans un plasmide?

A

Le plasmide qui contient ce gène peut être introduit dans une bactérie et lui conférer une résistance à l’ampicilline. Les bactéries ensemencées dans un milieu de culture contenant l’ampicilline mourront à moins de détenir le plasmide (qui contient le gène).

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10
Q

Qu’est-ce qu’un polylinker?

A

C’est un site de clonage multiple.

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11
Q

À quoi sert le polylinker?

A

À ouvrir le plasmide pour y ajouter un insert d’intérêt.

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12
Q

Marqueur de sélection :

A

Fait en sorte que la bactérie qui l’a intégré peut vivre alors qu’autrement, elle mourrait. Seules les cellules ayant le marqueur de sélection vont pousser.

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13
Q

Marqueur de criblage :

A

Permet de distinguer les cellules qui l’ont intégré de celles qui ne l’ont pas intégré. Toutes les cellules poussent donc avec le marqueur de criblage, mais sont différentes selon qu’elles l’ont intégré ou non.

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14
Q

Pourquoi est-ce que ce sont les colonies blanches qui contiennent l’insert dans le système avec le marqueur lacZ?

A

Parce que l’insert est introduit à l’intérieur du gène lacZ et cela fait en sorte que la protéine (bêta-galactosidase) associée n’est plus fonctionnelle, donc pas de production de pigment bleu en présence d’IPTG et de x-gal.

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15
Q

Expliquer la régulation de l’opéron lactose.

A

L’opéron lactose est constitué d’un promoteur, d’un opérateur et de gènes. Un gène régulateur produit constamment une protéine répresseur qui se fixe à l’opérateur et empêche la fixation de l’ARN polymérase au promoteur. Lorsque l’inducteur est présent, il se lie au répresseur et l’empêche de se lier à l’opérateur. L’ARN polymérase peut alors se lier au promoteur et débuter la transcription. Les gènes seront alors transcrits, puis traduits pour donner naissance à différentes enzymes, dont la bêta-galactosidase.

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16
Q

Promoteur constitutif :

A

Assure une transcription constante et régulière (peut être plus ou moins forte).

17
Q

Promoteur inductible :

A

Nécessite la présence d’un inducteur pour que la transcription débute.

18
Q

Quel est le rôle du terminateur dans le vecteur de clonage?

A

Il permet de stopper la transcription de façon autonome. L’ARNm peut tout de suite être relâché, et un nouvel ARNm synthétisé.

19
Q

Quand le marqueur nutritionnel est-il utilisé?

A

Généralement lorsque nous avons besoin d’un deuxième marqueur de sélection chez les vecteurs navettes (ceux qui sont utilisés chez deux organismes différents comme la bactérie et la levure).

20
Q

Qu’est-ce qu’un marqueur?

A

Un gène qui permet de synthétiser un métabolite essentiel qui n’est normalement pas synthétiser par l’organisme utilisé. Ainsi, l’organisme ne pourra pas survivre dans un milieu sans ce métabolite à moins qu’il n’ait intégré le gène (le marqueur) pour le fabriquer.

21
Q

Exemple marqueur nutritionnel :

A

Une levure incapable de synthétiser l’uracile ne pourra pas survivre dans un milieu sans uracile à moins d’avoir intégré un gène qui lui permet de fabriquer l’uracile, soit le marqueur nutritionnel.

22
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur navette?

A

Un vecteur qui peut être maintenu dans des organismes différents.

23
Q

Que doit contenir un vecteur navette que les vecteurs classiques ne possèdent pas?

A

Une origine de réplication supplémentaire

Un marqueur de sélection supplémentaire

24
Q

Dans quelle situation l’insertion d’un épitope dans un vecteur de clonage peut-il être utile?

A

Lorsque l’objectif est la purification de protéines.

25
Q

Quelle est l’utilité d’un marqueur de sélection dans un vecteur de clonage?

A

Pour sélectionner les cellules hôtes qui ont incorporées le vecteur ou le plasmide.

26
Q

Que sont les amorces universelles?

A

Ce sont des séquences trouvées chez plusieurs plasmides de clonage. Elles sont utilisées pour le séquençage de l’insert ou pour le PCR (vérifier la longueur de l’insert).

27
Q

Pourquoi serait-il intéressant d’utiliser des séquences d’amorces de part et d’autre des sites de clonage multiple du plasmide?

A

Pour pouvoir séquencer l’insert (connaître chacun des nucléotides de l’insert) et pour pouvoir amplifier l’insert, c’est-à-dire en faire suffisamment de copies pour pouvoir les faire migrer en visualiser ensuite sur un gel d’agarose et en déterminer la longueur approximative.

28
Q

Qu’est-ce qu’un site de clonage multiple?

A

Section du plasmide contenant une multitude de sites reconnus par des enzymes de restriction.