Exercices - clonage moléculaire Flashcards
Qu’est-ce que le clonage moléculaire?
L’amplification d’un fragment d’ADN par des microorganismes après son insertion dans un vecteur.
Quelles sont les grandes étapes pour la production d’un ADN recombinant?
Extraction des plasmides bactériens
Ouverture du plasmide par une enzyme de restriction
Extraction ou synthèse du gène ou de l’ADN d’intérêt
Ligation de l’ADN d’intérêt avec le plasmide ouvert
Réintroduction des plasmides dans des bactéries
Reproduction de l’ADN d’intérêt par la bactérie
Qu’est-ce qu’un plasmide?
Fragment d’ADN double brin, le plus souvent circulaire, que l’on retrouve dans le cytoplasme des bactéries ou levures. Il n’est pas indispensable à la cellule, mais lui confère différentes propriétés.
Quelles sont les principales caractéristiques du plasmide?
Circulaire
Double-brin
Présent dans le cytoplasme de plusieurs espèces bactériennes
Réplication autonome
Présence de divers gènes (résistance aux antibiotiques, métaux lourds)
À quoi sert un vecteur?
Il sert de transporteur.
En quoi le plasmide est-il un vecteur?
Il peut transporter des fragments d’ADN.
Quels sont les constituants essentiels d’un vecteur de clonage?
L’origine de réplication
Un gène de sélection
Site de clonage multiple
En quoi l’origine de réplication est-elle essentielle au plasmide?
Elle permet la réplication autonome et l’amplification du nombre de copies du vecteur.
Comment le gène de la bêta-lactamase peut-il être utilisé comme gène de sélection dans un plasmide?
Le plasmide qui contient ce gène peut être introduit dans une bactérie et lui conférer une résistance à l’ampicilline. Les bactéries ensemencées dans un milieu de culture contenant l’ampicilline mourront à moins de détenir le plasmide (qui contient le gène).
Qu’est-ce qu’un polylinker?
C’est un site de clonage multiple.
À quoi sert le polylinker?
À ouvrir le plasmide pour y ajouter un insert d’intérêt.
Marqueur de sélection :
Fait en sorte que la bactérie qui l’a intégré peut vivre alors qu’autrement, elle mourrait. Seules les cellules ayant le marqueur de sélection vont pousser.
Marqueur de criblage :
Permet de distinguer les cellules qui l’ont intégré de celles qui ne l’ont pas intégré. Toutes les cellules poussent donc avec le marqueur de criblage, mais sont différentes selon qu’elles l’ont intégré ou non.
Pourquoi est-ce que ce sont les colonies blanches qui contiennent l’insert dans le système avec le marqueur lacZ?
Parce que l’insert est introduit à l’intérieur du gène lacZ et cela fait en sorte que la protéine (bêta-galactosidase) associée n’est plus fonctionnelle, donc pas de production de pigment bleu en présence d’IPTG et de x-gal.
Expliquer la régulation de l’opéron lactose.
L’opéron lactose est constitué d’un promoteur, d’un opérateur et de gènes. Un gène régulateur produit constamment une protéine répresseur qui se fixe à l’opérateur et empêche la fixation de l’ARN polymérase au promoteur. Lorsque l’inducteur est présent, il se lie au répresseur et l’empêche de se lier à l’opérateur. L’ARN polymérase peut alors se lier au promoteur et débuter la transcription. Les gènes seront alors transcrits, puis traduits pour donner naissance à différentes enzymes, dont la bêta-galactosidase.