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Laboratoire de biochimie > Examen 2 (module 6 à 9) > Flashcards

Examen 2 (module 6 à 9) Flashcards

1
Q

Signification du mot : chromatographie

A

enregistrement graphique des couleurs

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Q

Expérience de Mikhaïl Tswett

A

Séparer pigments végétaux (clorophylle, xanthophylles)

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Q

Classification des différentes techniques de chromatographie est basée sur ________

A

la nature des ses phases (stationnaire et mobile)

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4
Q

Si phase stationnaire sur un support plat, la détection se fait ______

A

à même le support (TLC ou papier)

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Q

Quelle information peut-on tirer d’une chromatographie planaire? Comment on le calcule?

A

Rf = déplacement du composé/ déplacement solvant

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6
Q

Nommer les deux types de chromato planires

A

adsorption

de partage

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7
Q

Décrire la phase stationnaire et mobile de la chromato d’adsorption

A

stationnaire : adsorbant inorganique (silice)

mobile : mélange liquide dont polarité est semblable à l’échantillon

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8
Q

Comment peut être le silice dans des conditions normales de T et de H

A

trois couches d’eau

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9
Q

Comment activer le gel si trois couches d’eau sur gel de silice?

A

par chauffage

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10
Q

Quel est le goupement qui est le sites de liaison de la phase stationnaire pour les solutés?

A

silinol (Si-OH)

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11
Q

Vrai ou faux : le gel peut contenir un indicateur fluorescent inerte pour visualiser les composés après la séparation

A

Vrai

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12
Q

Décrire la phase stationnaire et mobile de la chromato de partage

A

stationnaire : liquide imbibé sur une phase stationnaire (papier, cellulose, billes recouvertes)
mobile : liquide dont polarité est généralement opposée à la phase stationnaire
séparation des composés de polarités différentes**

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13
Q

Comment fait on pour obtenir meilleure séparation possible concernant la phase mobile?

A

mélange de solvants

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14
Q

Comment fait on pour éviter évaporation de la phase mobile

A

placer un papier buvard dans la cuve durant la chromato

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15
Q

Si le silice est près des cations métalliques, qu’arrive-t-il?

A

devient acide

changement des propriétés

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16
Q

Dans un chromato plannaires, la reproductibilité du Rf dépend de nombreux facteurs tels que :

A 
qualité/ qte échantillon
qaulité/degré d'activation de stationnaire
épaisseur/uniformité stationnaire
qualité/nature solvants
degré saturation cuve
T/t de développement
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17
Q

Comment visualiser composés après chromato plannaires?

A

réactifs + traitement

récupérées et analysées par d’autres méthodes (spectro, ex.)

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18
Q

Où sont détectées les molécules?

A

Dans les différentes fractions de l’éluat

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19
Q

La séparation (chromato colonne) peut se baser sur:

A

taille
charge
hydrohobicité

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20
Q

Capacité à séparer deux composés dépend de leur _______. Comment est-il calculer? PLus il est grand, plus ____ sera le temps d’élution

A

coefficient de partition pour la phase stationnaire

K= [A] stationnaire/[A] mobile

grand

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21
Q

Quest-ce que a résolution dans le domaine de la chromato ?

A

capacité à séparer

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22
Q

Paramètres affectant résolution

A

capacité de a colonne
efficacité de la colonne (vitesse de diffusion et débit)
Sélectivité de la colonne (distance entre les Ve)
tuyau de sortie de la colonne (perte si grande d et grande longueur)

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23
Q

Types de chromato sur colonne

A

exclusion
hydrophobicité
échangeur ionique
affinité

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24
Q

Décrire phase stationnaire chromato exclusion

A

matériau inerte avec pores dimension définie

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25
Q

Séparation selon ___ pour la chromato exclusion

A

taille

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26
Q

Quest ce que le volume mort?

exemple de molécules utilisées pour le calculer

A

volume d’élution d’une molécule exclue de la phase stationnaire
Bleu de Dextran

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27
Q

Quest ce que le Ve?

A

volume de phase mobile requis pour éluer le plus grande [A]

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28
Q

Quest ce que Wa et commet le mesurer a l’aide d’un graphique?

A

largeur du pic

distance entre début pic et fin du pic

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29
Q

Que signifie Kav?

A

Coefficient de partage moyen entre la phase mobile et la phase stationnaire

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30
Q

Comment calculer Kav

A

Kav = Ve - Vo / Vt-Vo (doit etre plus petit ou egal a 1)

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31
Q

Paramètre qui affectant chromato d’exclusion

A 
phase stationnaire 
type de gel 
débit de l'élution 
pression supportée 
taille des billes 
hauteur et diametre de la colonne 
volume du dépôt
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32
Q

Applications possibles de la chromato

A

Purification d’une protéine selon sa taille
Détermination de la taille native d’une protéine
Séparation de groupes (dessalage)

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33
Q

Nommer une autre façon de séparer des groupes

A

Dialyse (dessalage)

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34
Q

Décrire phase stationnaire d’une chromato échange d’ions

A

ions (anions ou cations) de signe opposé à celui des composantes de l’échantillon

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35
Q

Dans une chormato d’exclusion, plus la charge est grande, plus l’ion est attiré et plus le temps d’élution est _______

A

long

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36
Q

Décrire la phase mobile d’une chormato échange d’ions

A

tampon aqueux à pH variable pour modifier les temps d’élutions

37
Q

Nommer deux échangeurs populaires en biochimie

A

anionique : DEAE-cellulose

cationique : CM-cellulose

38
Q

Paramètres affectant séparation composés chromato échange d’ion

A

phase stationnaire
pH de la phase mobile
force ionique de la phase mobile
T

39
Q

Dans une chromato échange d’ions, l’interaction est favorisée à _____ T

A

basse

40
Q

Dans une chromato échange d’ion, l’interaction est favorisée à ______ [sel]

A

faible

41
Q

La force ionique d’une solution dépend de la _____ et de leur ______

A

[ions en solution]

nature (monovalent, divalent)

42
Q

La conductivité d’une solution n’est pas directement reliée à sa force ionique, vrai ou faux

A

faux, directement liée

43
Q

Comment mesure-t-on la conductivité?

A

avec un conductimètre

44
Q

Échangeur anionique utilisé à un ______ pH

A

haut

donc grande charge positive de surface et solutés négatifs

45
Q

Échangeur cationique utilisé à un ______ pH

A

bas

donc grande charge négative de surface et solutés positif

46
Q

L’élution par le pH est elle la meilleure méthode?

A

Non garde pourrait dénaturer, meilleure méthode est par le sel

47
Q

Exemple d’application de la chromato échange d’ions

A

purification protéine selon sa charge

Séparation d’acide aminé

48
Q

Réviser diapo 12 pour l’approche direct pour trouver conditions de chromato

A

aller vas voir ! ;)

49
Q

Dans une chromato d’hydrophobicité, de quoi est composé la phase stationnaire

A

adsorbant légèrement hydrophobe

50
Q

Dans quelles conditions les solutés vont se lier à la surface pour diminuer exposition à l’eau dans chromato d’hydro

A

en solution aqueuse

haute force ionique

51
Q

De quoi est composé la phase mobile d’une chromato d’hydro

A

tampon aqueux

riche en sel (peut être réglé pour contrôler t d’élution)

52
Q

Paramètres affectant séparation dans chromato d’hydro

A

phase stationnaire : plus chaine longue, plus grande est l’interaction, mais si trop grande la phase mobile devra être non polaire (chromato inverse, RPC)
pH phase mobile
Type/ [sel] dans phase mobile
T

53
Q

Dans chromato d’hydro, l’interaction est favorisée à ____ [sel]

A

haute

54
Q

Dans chromato d’hydro, l’interaction est favorisée à ___ T

A

haute

55
Q

De quoi est composé la phase stationnaire dans chromato d’affinité

A

ligand immobilisé sur support solide

56
Q

Comment est l’interaction entre la matrice et les solutés dans une chromato d’affinité

A

spécifique et réversible

57
Q

Nommer des interactions récepteurs-ligands

A

enzyme - substrat
anticorps - antigène
récepteur - hormone
protéine - ADN

58
Q

Propriété de la matrice pour une chromato d’affinité

A

inerte : pas autres interactions
poreuse : passer biomolécules
rigide et stable aux T et pH
forte densité de groupes réactifs

59
Q

Étapes purification rapide par IMAC d’une protéine

A

Ajout 6-10 His
Insère site de clivage entre His et protéine originale
Colonne avec Ni ou de Co
His s’y accroche
élution du reste avec faible [imidazole]
élution Protéine - His avec forte [imidazole]
Enlève His avec protéase
Chromato pour séparer His des protéines

60
Q

Nommer autres types de chromato

A 
Sur hydroxyapatite (HAP) : matrice de Ca, interaction avec protéines/ acides nucléiques
Sur mbr ou résine de silice : purification ADN/ARN, lysé --> résine -->lavage avec éthanol -->élution ADN avec sln aq à pH alcalin
61
Q

Comment entretenir les colonnes

A 
lavage + régénération 
Entreposage dans NaN3 ou EtOH
température : 4 °C
Respecter pression (débit) 
Refroidir + filtrer phases mobiles sur 0,45 uM
Dégazer pahse mobile (FPLC, HPLC)
62
Q

Nommer différences entre FPLC et HLPC

A

HPLC : tubulure acier (vs plastique)
pureté, qte, agrégation (vs pureté seulement)
petit volume (vs gros volume)
petite colonne (vs grosse colonne)
RPC (vs affinité, échange d’ions, IMAC, hydro, exclusion)
plusieurs types de molécules (vs protéines)

63
Q

En quoi consiste l’électrophorèse?

A

Migration molécules dans champ électrique créé par deux électrodes

64
Q

Comment se nomme l’électrode attirant les charges positives? négatives?

A

Cathode (-)

Anode (+)

65
Q

En quoi consiste le buvardage?

A

Passage des molécules d’un gel après électrophorèse à une membrane

66
Q

Comment calculer la vitesse de déplacement des molécules dans une champ électrique?

A

v = (Eq)/f

67
Q

Nommer les trois composantes d’un appareil faisant une électrophorèse?

A

Source d’alimentation (E)
Tampon d’électrophorèse (q)
Support

68
Q

Il y a électroendosmose si le support n’est pas __________.. Que se passe-t-il si ce n’est pas le cas?

A

électriquement neutre

Si chargé, entraîne un courant de solvant

69
Q

Un support peut être positionné ______ ou _______. Donner un exemple pour chaque

A

verticalement ou horizontalement

agarose vs PAGE

70
Q

Quel type de gel est couramment utilisé pour l’électrophorèse des protéines?

A

PAGE

71
Q

Comment préparer le gel de polyacrylaminde? Nécessite des radicaux libres fournis par ? Stabilisé par?

A

polymérisation de monomères d’acrylamide
Persulfate d’ammonium
TEMED

72
Q

Vrai ou faux, l’oxygène est essentiel à la polymérisation du gel de polyacrylamide?

A

Faux, il y a inhibition

73
Q

Comment enlever l’oxygène lors de la confection d’un gel de polyacrylamide?

A

Dégazage

Polymérisation entre deux plaques avec une couche d’eau ou d’alcool

74
Q

Une électrophorèse non dénaturante dépend de :

A

charge
taille
forme

75
Q

Comment la charge varie-t-elle suite à un changement de pH? Les molécules se dirigeront alors vers l’anode ou la cathode?

A

Augmentation de pH : charge négative, direction vers l’anode
Diminution de pH: charge positive, direction vers la cathode
Charge nulle : aucune migration

76
Q

Applications courantes d’un gel en conditions non-dénaturantes

A 
point isoélectrique d'une protéine (IEF)
étude structurale (monomère, dimère)
Conserver activité enzymatique 
1ère dimension d'un gel 2-D
étude interactions protéines-ADN, protéines-protéines
77
Q

Méthode pour déterminer focalisation isoélectrique sur un gel

A

gradient de pH dans une microélectrode
Ajout de la protéine
Champ électrique
L’arrêt de la migration implique qu’il s’agit de pI.

78
Q

Une électrophorèse dénaturantes dépend de :

A

taille

79
Q

Applications courantes d’une électrophorèse en conditions dénaturantes

A

déterminer masse moléculaire d’une protéine
suivre purification protéine
détermination de la présence de sous-unités + taille d’un enzyme
2ème dimension d’un gel 2-D
Déterminer si une protéine est correctement repliées

80
Q

Comment dénaturer une protéine

A

Chaleur
SDS
Agent réducteur (B-mercaptoéthanol
Urée

81
Q

À quoi sert le SDS?

A

bris liens non covalents
Donne charge négative en fonction de la taille (explique pourquoi ne dépend pas de la charge)
Empêche les protéines dénaturées de s’agréger et de précipiter

82
Q

À quoi sert le B-mercaptoéthanol?

A

Bris pont disulfure

83
Q

On mentionne que l’électrophorèse en conditions dénaturantes est un système continu ou discontinu? Pk?

A

discontinu

Il y a plusieurs gradient de pH et de concentration de SDS dans le gel

84
Q

Expliquer le fonctionne d’un gel de concentration

A

Les ions Cl- se dirige vers la borne positive (anode) rapidement tout comme les protéines
La glycine aussi mais dès qu’elle entre dans la section du gel qui a un pH de 6,08, elle s’arrête (migre lentement), car sa charge est presque de 0
Il y a donc une barrière inférieur (glycine) et supérieur (Cl-) aux protéines.
Haut voltage provoquant empilement
Quand le tout atteint le gel de séparation avec un pH de 8.8, les ions glycines se charges négativement et vont plus vite
Il y a donc séparation selon la taille des protéines étant donné un % d’acrylamide du gel plus élevé.

85
Q

Utilisé d’un gel de concentration

A

Plus d’échantillon que l’on peut y déposer

Pour que les protéines entrent en même temps dans le gel de séparation (formation d’une bande mince et non diffuse

86
Q

Comment détecter les protéines sur le gel suite à une électrophorèse?

A

fixation avec acide acétique et du méthanol
Utilisation de colorants : Bleu de Coomassie R-250 ou Nitrate d’argent
Buvardage : molécules accessibles à la détection par des sondes (anticorps)

87
Q

Comment déterminer la taille des protéines après une SDS-PAGE?

A

d parcourue 1/proportionnelle au log10 de leur masse

Courbe de calibration

88
Q

Expliquer l’électrophorèse 2D

A

Séparation avec gel non dénaturant selon le pI

Séparation selon la masse moléculaire avec un gel dénaturant SDS-PAGE

89
Q

Qu’est-ce que le 2D-DIGE?

A

Coloration préalable à l’électrophorèse
Migration
Éclaire avec différentes longueurs d’onde

Laboratoire de biochimie (3 decks)

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