Examen 1: Biologie moléculaire Flashcards
ADN (Acide Désoxyribonucléique)
Molécule formée de deux brins antiparallèles en double hélice, composée de nucléotides (A, T, G, C). C’est le support principal de l’information génétique.
ADN plasmidique (plasmide)
Petite molécule d’ADN circulaire, distincte du chromosome bactérien, pouvant se répliquer de façon autonome. Souvent utilisée comme vecteur d’expression.
ADNc (ADN complémentaire)
ADN synthétisé à partir d’ARNm via la transcriptase inverse. Il ne contient pas d’introns, car il dérive d’un ARN déjà épissé.
Amorces (Primers)
Courtes séquences d’ADN complémentaires des extrémités 3’ de la région à amplifier. Elles amorcent la synthèse lors de la PCR.
AmpR (Ampicilline résistance)
Gène de résistance à l’ampicilline, permettant la sélection des bactéries transformées en milieu contenant l’antibiotique.
Appariement des bases
A s’apparie à T (2 ponts H) et G s’apparie à C (3 ponts H) dans l’ADN, assurant la complémentarité entre brins.
Bactéries compétentes
Cellules modifiées (chimiquement ou par électroporation) pour être capables d’absorber de l’ADN étranger.
Chromatographie d’affinité
Technique de purification exploitant une interaction spécifique (ex. : GST-glutathion) pour isoler la protéine cible.
Clivage (avec une protéase)
Action de couper une protéine de fusion (ex.: GST + protéine d’intérêt) pour séparer l’étiquette de la protéine.
Conjugaison
Transfert d’ADN (souvent plasmidique) d’une bactérie donneuse à une bactérie receveuse via un pilus sexuel.
Criblage (gène de criblage)
Gène (ex. lacZ) permettant d’identifier si le plasmide est recombinant (colonies blanches vs bleues en présence de X-Gal).
Dénaturation (PCR)
Étape de la PCR (94 °C) où les deux brins d’ADN se séparent (rupture des ponts H).
dNTPs (désoxyribonucléotides triphosphates)
dATP, dTTP, dGTP, dCTP: monomères dont l’ADN polymérase a besoin pour synthétiser de nouveaux brins.
Électrophorèse sur gel d’agarose
Méthode de séparation des fragments d’ADN selon leur taille sous champ électrique (migration vers la borne +).
Enzymes de restriction
Endonucléases qui reconnaissent des séquences d’ADN spécifiques et les coupent (ex. EcoRI).
Extrémités cohésives (sticky ends)
Coupures en escalier laissant des bases complémentaires libres, facilitant la ligation d’un fragment compatible.
Extrémités franches (blunt ends)
Coupures droites, sans surplomb de bases. Moins propices à l’hybridation spontanée que les « sticky ends ».
Gène d’intérêt (insert)
Segment d’ADN codant la protéine que l’on veut produire ou étudier. On l’insère dans un vecteur.
Gène de sélection
Gène (AmpR, par ex.) conférant une résistance à un antibiotique, permettant de sélectionner les cellules transformées.
Gène lacZ
Code la β-galactosidase. Souvent utilisé pour le criblage (colonies bleues si intact, blanches si interrompu).
GST (Glutathion-S-Transférase)
Enzyme utilisée comme étiquette de fusion pour purifier la protéine (affinité pour le glutathion).
Hybridation (PCR)
Étape de la PCR (env. 37-72 °C) où les amorces se fixent de façon complémentaire aux brins dénaturés.
Liaison phosphodiester
Liaison covalente entre le groupement phosphate et le sucre (désoxyribose) de nucléotides adjacents.
Ligation (ADN ligase)
Réaction de jonction de deux fragments d’ADN (extrémités cohésives ou franches) grâce à l’ADN ligase.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Technique permettant d’amplifier exponentiellement un fragment d’ADN cible via cycles de dénaturation, hybridation, élongation.
Promoteur
Séquence d’ADN où se fixe l’ARN polymérase pour débuter la transcription d’un gène (ex. promoteur lac).
Protéine de fusion
Protéine recombinante constituée de la protéine d’intérêt + une étiquette (ex. GST) pour faciliter sa purification.
Protéine recombinante
Protéine produite par un organisme ayant intégré de l’ADN étranger (ex. insuline humaine exprimée par E. coli).
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
Variation de la PCR démarrant d’un ARN, converti en ADNc par la transcriptase inverse, puis amplifié.
Site de clonage multiple (SCM/MCS)
Région d’un plasmide comportant plusieurs sites de restriction distincts pour insérer un gène d’intérêt.
Superenroulé (supercoiled)
Forme la plus compacte d’un plasmide (non coupé), migrante plus rapide en électrophorèse sur gel d’agarose.
Taq polymérase
ADN polymérase thermostable, isolée de Thermus aquaticus, supportant les températures de dénaturation en PCR.
Transformation (bactérienne)
Introduction d’un ADN étranger (plasmide ou autre) dans une bactérie, lui conférant un nouveau caractère.
Transduction
Transfert d’ADN d’une bactérie à une autre par l’intermédiaire d’un bactériophage (virus).
Transcriptase inverse
Enzyme rétrovirale convertissant l’ARN simple brin en ADNc (outil crucial en RT-PCR).
Qu’est-ce qu’une protéine recombinante?
Une protéine produite par un organisme (bactérie, levure, cellule de mammifère, etc.) après introduction d’un ADN étranger codant cette protéine.
Donne un exemple concret de protéine recombinante.
L’insuline humaine produite par E. coli pour traiter le diabète.
Quels sont les 3 grandes étapes pour produire une protéine recombinante?
1) Amplifier/purifier l’ADN (gène d’intérêt). 2) Introduire l’ADN dans des cellules hôtes. 3) Purifier la protéine produite.
Quels mécanismes naturels de transfert d’ADN existent chez les bactéries?
Transformation (ADN nu), conjugaison (via pilus), et transduction (via bactériophage).
Quels sont les grandes lignes d’un protocole de production sur plusieurs semaines?
Semaine 1-3: transformation, sélection, culture, extraction/enzymes de restriction, électrophorèse. Semaine 4-5: induction, lyse cellulaire, purification de la protéine, dosage, analyse.
Pourquoi l’ADN est-il antiparallèle?
Les deux brins sont orientés en sens opposé (5’→3’ et 3’→5’), assurant l’appariement complémentaire des bases (A–T, G–C).
Qu’est-ce que la réplication semi-conservative?
Chaque nouvelle molécule d’ADN contient un brin ancien et un brin néoformé.
Quels sont les composants indispensables pour une PCR?
ADN matrice, amorces, Taq polymérase, dNTPs, tampon (Mg²+), cycles (dénaturation, hybridation, élongation).
Comment appelle-t-on le segment amplifié par PCR?
Le segment cible ou l’amplicon, défini par la séquence des amorces.
Pourquoi utilise-t-on souvent Taq polymérase pour la PCR?
Elle est thermostable et résiste aux hautes températures (94-95 °C) de dénaturation.
Quel est le rôle des enzymes de restriction en clonage moléculaire?
Elles coupent l’ADN (vecteur et insert) à des sites spécifiques, générant des extrémités cohésives ou franches pour la ligation.
Décris brièvement la formation d’un ADN recombinant.
1) Digestion plasmide + insert (même enzyme).
2) Hybridation (extrémités cohésives complémentaires s’apparient).
3) Ligation (ADN ligase).
**4) ** Plasmide recombinant
Comment sélectionne-t-on les bactéries transformées?
Sur gélose + antibiotique (ex.: ampicilline). Seules les bactéries portant le plasmide (gène AmpR) survivent.
À quoi sert le gène lacZ dans le criblage?
Il permet de distinguer plasmide non recombinant (lacZ intact→ bleu) de plasmide recombinant (lacZ interrompu→ blanc) en présence de X-Gal.
Qu’est-ce que la conjugaison?
Un transfert de plasmide (ou d’ADN) d’une bactérie à une autre via un pilus (méthode naturelle sexué chez les bactéries).
Qu’est-ce qu’un plasmide pGEX?
Un vecteur plasmidique possédant Ori, AmpR, un site de clonage multiple et le gène GST pour la fusion protéique.
Qu’est-ce que pGEX-RecP1?
C’est le plasmide pGEX contenant déjà l’ADNc du gène RecP1 inséré (au site SmaI), menant à la production de la protéine GST-RecP1.
Pourquoi produire une protéine de fusion (ex. GST-RecP1)?
Pour la purifier facilement via chromatographie d’affinité (GST se lie au glutathion), améliorer la solubilité/détection.
Comment récupère-t-on la protéine RecP1 seule si elle est fusionnée à GST?
En utilisant une protéase spécifique (ex. thrombine) pour cliver l’étiquette GST et libérer la protéine RecP1.
Quels sont les 4-5 grandes étapes pratiques pour la production de GST-RecP1?
1) Transformation BL21. 2) Culture + ampicilline. 3) Induction de l’expression (IPTG). 4) Lyse cellulaire (sonication). 5) Purification sur colonne glutathion. (Option clivage GST).
En quoi consiste la RT-PCR?
C’est une PCR qui part d’ARN: la transcriptase inverse synthétise l’ADNc, puis amplification par PCR classique.
Pourquoi utilise-t-on l’ADNc plutôt qu’un gène eucaryote complet?
Les bactéries ne font pas d’épissage, donc l’ADNc (sans introns) est directement exprimable. Un gène avec introns serait mal lu.
Cite une application du qRT-PCR (PCR quantitative en temps réel).
- Quantifier les niveaux de transcription d’ARN dans les cellules et les tissus.
- Détecter et quantifier des batéries dans des étendues d’eau.
- Diagnostiquer des virus.
Pourquoi l’ADN migre-t-il vers la borne positive en électrophorèse?
Car il est chargé négativement (groupements phosphate) et est donc attiré par la borne +.
Comment estime-t-on la taille des fragments d’ADN sur un gel d’agarose?
En comparant leur distance de migration à une échelle (DNA ladder) dont on connaît les tailles.
Quels colorants sont utilisés pour visualiser l’ADN?
Bromure d’éthidium (mutagène) ou SYBR Safe (moins toxique), révélés aux UV.
Quelles sont les formes principales d’un ADN plasmidique sur gel?
1) Superenroulé (supercoiled), 2) Linéaire (coupure double brin), 3) Circulaire ouvert (nicked).
Comment le pourcentage d’agarose affecte-t-il la séparation?
Un gel peu concentré (0,7-1 %) sépare mieux les grands fragments (500-10 000 pb). Un gel plus concentré (1,5-2 %) sépare mieux les petits fragments.
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction?
Une endonucléase bactérienne coupant l’ADN à une séquence cible spécifique (4-8 nt).
Quelle différence y a-t-il entre extrémités cohésives et extrémités franches?
Cohésives : coupures décalées « sticky ». Franches : coupures droites (blunt).
Qu’est-ce qu’une carte de restriction?
Schéma indiquant où chaque enzyme de restriction coupe un plasmide (position en pb), permettant de prédire la taille des fragments.
Comment vérifie-t-on la présence d’un insert par digestion enzymatique?
On compare la taille des fragments obtenus (sur gel) avec la taille attendue (ex. plasmide + 650 pb).
Donne un exemple d’exercice de digestion multiple.
Ex. enzyme A + B : 5 fragments, Enzyme C seule : 1 fragment (pas de site de coupure). On compare au gel pour confirmer.
Pourquoi place-t-on les bactéries sur glace avant le choc thermique?
Pour diminuer la fluidité membranaire et favoriser l’adhésion de l’ADN sur la surface cellulaire avant l’étape à 42 °C.
À quoi sert la période de récupération sans antibiotique après la transformation?
Permet aux bactéries d’exprimer le gène de résistance avant d’être exposées au milieu sélectif.
Comment dose-t-on la concentration d’une protéine purifiée?
Par une courbe standard (ex. BSA) via méthodes colorimétriques (Bradford, BCA).
Quelle différence entre un gel d’agarose et un gel SDS-PAGE?
Agarose : séparer l’ADN (nucléiques) selon la taille (pb). SDS-PAGE : séparer des protéines selon leur masse moléculaire (kDa).
Quelles formes peut prendre un plasmide sur gel d’agarose?
Superenroulé (le plus rapide), linéaire (vitesse intermédiaire), ou circulaire ouvert (le plus lent).
Quel est le « workflow » général pour produire une protéine recombinante?
1) Identifier/amplifier gène (PCR), 2) Insertion dans un plasmide (restriction/ligation), 3) Transformation + sélection, 4) Vérification sur gel, 5) Expression et purification.
Pourquoi est-il crucial de maîtriser l’analyse de gels et la lecture de cartes de restriction?
Pour confirmer la présence/l’orientation de l’insert, vérifier le bon plasmide, et ainsi éviter des échecs avant l’étape d’expression.
Quelle est la différence majeure entre la PCR et la RT-PCR?
PCR = matrice ADN. RT-PCR = matrice ARN, converti en ADNc (par transcriptase inverse) avant l’amplification.
