Biologie: Examen 2 Flashcards
Protéine de fusion
Protéine recombinante qui inclut la protéine d’intérêt + une étiquette (ex. GST). Facilite la purification ou la détection.
E. coli BL21
Souche d’Escherichia coli utilisée pour la production de protéines (expression), avec moins de protéases et adaptée à la surexpression.
Promoteur tac
Promoteur inductible dérivé de l’opéron lac, contrôlé par le répresseur lacI, activé par l’IPTG. Il permet la transcription du gène d’intérêt en protéine lorsqu’il n’est pas empêché par lacI.
Protéine recombinante
Protéine produite par un organisme dont le matériel génétique a été modifié (ex. introduction d’un plasmide).
IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)
Inducteur analogue du lactose, se lie au répresseur lacI et autorise la transcription du gène sous le promoteur tac. Non hydrolysé par les bactéries.
Lysat cellulaire
Extrait contenant l’ensemble des protéines et constituants libérés après la rupture (lyse) des cellules.
Sonication
Technique (ultrasons) pour briser les parois bactériennes et libérer le contenu cellulaire.
Lysozyme
Enzyme qui dégrade la paroi des bactéries, facilitant la lyse.
Triton X-100
Détergent non ionique qui solubilise les protéines et les membranes lors de la lyse.
Chromatographie d’affinité
Méthode de purification exploitant une interaction spécifique (ex. GST ↔ glutathion).
Glutathion
Tripeptide (Glu-Cys-Gly) auquel la GST se lie fortement, permettant la purification sur colonne.
Billes Sepharose-glutathion
Support de chromatographie d’affinité : le glutathion est fixé sur des billes de Sepharose, retenant la GST ou GST-RecP1.
Dosage protéique (ex. Bio-Rad)
Technique colorimétrique mesurant la concentration en protéines. On compare l’absorbance à une courbe standard (ex. BSA).
BSA (Bovine Serum Albumin)
Protéine standard servant à établir la courbe de calibration lors du dosage (méthode Bradford ou DC Protein Assay).
Facteur de dilution
Le nombre par lequel on multiplie la concentration lue pour retrouver la concentration réelle de l’échantillon (ex. x10 si dilution 1/10).
SDS-PAGE
Électrophorèse sur gel d’acrylamide en présence de SDS, séparant les protéines selon leur masse moléculaire.
Gel d’acrylamide
Support vertical utilisé en SDS-PAGE, plus fin que l’agarose, adapté à la séparation des protéines.
Stacking gel (gel concentrateur)
Couche supérieure du gel d’acrylamide (faible %), qui concentre les protéines en une bande avant la séparation.
Running gel (gel séparateur)
Couche inférieure du gel d’acrylamide (plus fort %), où s’effectue la séparation réelle des protéines selon leur taille.
β-mercaptoéthanol
Agent réducteur (ou DTT) qui rompt les ponts disulfure dans les protéines, assurant leur dénaturation.
Marqueur de poids moléculaire (protein ladder)
Mélange de protéines de tailles connues, servant de référence pour estimer la masse (kDa) des protéines analysées.
Western Blot (immunobuvardage)
Technique qui transfère les protéines depuis un gel SDS-PAGE sur une membrane, puis les détecte via des anticorps spécifiques.
Anticorps primaire (Ac¹)
Anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine d’intérêt (ex. anti-GST).
Anticorps secondaire (Ac²)
Anticorps dirigé contre l’anticorps primaire, couplé à une enzyme (HRP…), permettant la révélation colorimétrique/lumineuse.
Flow through
Fraction qui ne s’est pas fixée sur la colonne de chromatographie (sans affinité).
Cadre de lecture (in frame)
Manière de lire les triplets (codons). L’ADNc de RecP1 doit s’insérer dans le même cadre que GST pour produire la protéine fusion correcte.
Extrait total « non induit »
Échantillon provenant de bactéries sans IPTG, produisant peu ou pas de protéine recombinante.
Extrait total « induit »
Échantillon provenant de bactéries traitées à l’IPTG, manifestant une forte expression de GST ou GST-RecP1.
Fusion GST-RecP1
Protéine hybride ~50 kDa formée par GST (25 kDa) et RecP1 (25 kDa) en cadre de lecture continu.
Opéron lac
Régule l’expression de gènes impliqués dans la digestion du lactose (ex. lacZ). Le promoteur tac en est dérivé.
Clivage (ex. par la thrombine)
Action de séparer l’étiquette GST de la protéine RecP1, si besoin, après la purification.
Transcription
Processus par lequel l’ARN polymérase synthétise un ARNm à partir d’un gène (promoteur → ARNm).
Traduction
Assemblage des acides aminés en protéine par les ribosomes, à partir de l’ARNm (début au codon START, fin au codon STOP).
Promoteur
Séquence d’ADN où l’ARN polymérase se fixe pour initier la transcription d’un gène.
pGEX vs pGEX-RecP1
pGEX : plasmide produisant la protéine GST seule (~25 kDa).
pGEX-RecP1 : plasmide produisant la protéine de fusion GST-RecP1 (~50 kDa).
Où et pourquoi ajoute-t-on l’ADNc de RecP1 ?
Dans le site de clonage multiple (SCM) du plasmide pGEX, en phase (in frame) après le gène GST, pour produire GST-RecP1.
Quelle souche utilise-t-on pour produire les protéines ?
E. coli BL21, car elle est adaptée à l’expression de protéines (moins de protéases, etc.).
Quel est le principe du promoteur tac ?
C’est un promoteur dérivé de l’opéron lac, réprimé par lacI, activable par l’IPTG.
Pourquoi l’IPTG n’est-il pas consommé par la bactérie ?
Parce qu’il est non hydrolysable, à la différence du lactose. Sa concentration reste donc stable.
Quand ajoute-t-on l’IPTG ?
Généralement en fin de phase exponentielle (OD600 ~ 0,6–1,0) pour maximiser la biomasse et la production de protéines.
Pourquoi ne pas induire trop tôt ni trop tard ?
Trop tôt : la bactérie pourrait être affaiblie (toxicité, moins de croissance). Trop tard : la culture vieillit, la division et le rendement diminuent.
Comment récupère-t-on les protéines après l’induction ?
On récolte les bactéries par centrifugation, puis on lyse (sonication, lysozyme, Triton) pour obtenir un lysat cellulaire.
Quelle est la différence E. coli DH5α vs BL21 ?
E. coli DH5α:
* Ce sont de véritables usines à plasmides puisqu’on a désactivé des endonucléases
E. Coli BL21: Ce sont de véritables usines à protéines puisqu’on a désactivé des protéases
Pourquoi la protéine recombinante peut-elle être toxique pour la bactérie ?
Parce que la surexpression mobilise beaucoup de ressources, ou que la protéine produite perturbe les fonctions cellulaires.
Quel est l’intérêt d’avoir muté certaines endonucléases et protéases ?
Pour éviter la dégradation du plasmide (endonucléases) ou de la protéine (protéases) et améliorer la stabilité de l’expression.
À quoi sert la chromatographie d’affinité ?
À purifier une protéine d’intérêt grâce à une interaction spécifique (ex. GST ↔ glutathion).
Quelles sont les étapes principales de la chromatographie d’affinité ?
1) Binding (liaison) sur colonne, 2) Lavage (washing), 3) Élution (avec du glutathion libre).
Comment détermine-t-on la concentration de protéine purifiée ?
On réalise un dosage colorimétrique (ex. Bio-Rad), en comparant l’absorbance à une courbe standard (BSA).
Pourquoi faire des dilutions multiples lors du dosage ?
Pour s’assurer que l’absorbance mesurée reste dans la gamme linéaire de la courbe standard.
Comment calcule-t-on la concentration finale ?
On reporte l’absorbance sur la courbe (y=mx+b), puis on multiplie par le facteur de dilution.
Quelle masse la GST fait-elle environ ?
GST seule pèse environ 25 kDa. La fusion GST-RecP1 fait ~50 kDa.
Que se passerait-il si on n’ajoute pas de glutathion libre en phase d’élution ?
La protéine GST (ou GST-RecP1) resterait fixée sur la colonne, car aucune compétition pour libérer la protéine.
Pourquoi la GST est-elle un bon tag de purification ?
Elle est relativement stable, améliore parfois la solubilité de la protéine, et interagit très spécifiquement avec le glutathion (affinité forte).
Pourquoi ne pas utiliser un gel d’agarose pour les protéines ?
Car l’agarose est trop grossier ; on préfère l’acrylamide (SDS-PAGE) pour séparer des protéines de plus petite taille.
Qu’apporte le SDS aux protéines ?
Il les dénature et leur confère une charge négative uniforme, de sorte qu’elles se séparent par masse moléculaire.
Comment lit-on un gel SDS-PAGE ?
On compare la distance de migration à un marqueur de poids moléculaire, et on observe la présence/absence de bandes.
Comment confirme-t-on l’identité d’une bande sur le gel ?
Par Western Blot : on transfère sur membrane et on utilise un anticorps spécifique (anticorps primaire), puis secondaire pour la révélation.
Que signifie une bande unique dans la fraction purifiée ?
Que la protéine d’intérêt est très majoritaire/pure, sans contamination significative.
Quel est l’intérêt du Western Blot ?
Confirmer qu’une bande donnée est bien la protéine recombinante (ex. GST-RecP1) via un anticorps spécifique.
Quelles sont les étapes du Western Blot ?
1) Transfert (des protéines du gel SDS-PAGE vers une membrane),
2) Blocage (avec du lait ou de la BSA pour empêcher les fixations non spécifiques),
3) Anticorps primaire (reconnaît spécifiquement la protéine d’intérêt),
4) Anticorps secondaire + enzyme (reconnaît l’anticorps primaire et est couplé à une enzyme comme HRP),
5) Détection (par ajout d’un substrat colorimétrique ou chimiluminescent que l’enzyme transforme en un signal détectable).
Exemple de contrôles en SDS-PAGE ?
- pGEX sans IPTG : pas de bande 25 kDa\n- pGEX avec IPTG : bande ~25 kDa\n- pGEX-RecP1 avec IPTG : bande ~50 kDa.
Comment agit la β-mercaptoéthanol ?
Elle réduit les ponts disulfure (S-S), aidant la dénaturation complète des protéines avant SDS-PAGE.
Quel est le rôle du stacking gel ?
Rassembler/concentrer les protéines en une seule bande avant leur entrée dans le gel de séparation (running gel).
Pourquoi colorer le gel SDS-PAGE (bleu de Coomassie) ?
Pour visualiser les bandes de protéines après la migration, déterminer la pureté et estimer leur taille.
Que faire si la protéine forme des corps d’inclusion (insoluble) ?
Adapter les conditions (température plus basse, induction plus courte), ajouter des additifs de solubilisation ou tenter un repliement in vitro.
