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Bio Mol Med > exam 2 > Flashcards

exam 2 Flashcards

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Biology 101 flashcards
1
Q

À quoi servent les techniques de blot?

A

À étaler le génome et identifier des gènes/prots spécifiques en utilisant des sondes.

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Q

Comment fonctionne le Sblot, Nblot et Wblot?

A

Coupe ADN/ARN et fait migrer ADN/ARN/prots par poids mol

Sblot: pour ADN, sondes ADN fragment

Nblot: pour ARN sonde ARN fragment

Wblot: pour prots, sonde anticorps

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3
Q

Comment fonctionnent les sondes ADN/ARN pour la détection/quantification?

A

simple brin complémentaire de la séquence recherchée de 20 nucléotides et + lié à une molécule drapeau.
Ex: radiacotivité (P32), luminescence, fluorescence

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4
Q

Quelles sont les méthodes pour détecter et quantifier l’ADN, l’ARN et les prots. Les séparer par en vitro ou in vivo et dire le type de sonde utilisée.

A

In vitro
1. Sblot: DNA fragm
2. PCR: DNA primer ( pour identifier quantifier ADN)
3. Nblot: ARN fragm
4. RT-PCR: DNA primer (pour ident/quant ARN0
5. Wblot : anticorps

In vivo
1. fluorescence in situ: ADN fragm
2. In situ hybridation: ARN fragm
3. immunofluorescence: anticorps

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5
Q

Quelle est la plus grande difficulté de la thérapie génique?

A

L’insertion de l’ADN normal dans les cellule s à changer par un virus mettons.

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6
Q

Expliquer le principe de stringence dans la dénaturation/renaturation de l’ADN double brin. Sur quels facteurs on joue pour le faire augmenter/diminuer?

A

La stringence décrit les conditions qu’on utilise pour l’hybridation de nos sondes. Dépendemment du degré d’homolgie entre la sonde et la séquence spécifique, des conditions de hautes et basses stringence sont utilisées.

Forte: ++ chaleur et – NaOH(sels). Permet hybridation de sondes très homologues. Si trop fort, rien qui bind.

Faible: – chaleur ++ NaOH. Permet hybridation de sondes moins homologues. Si trop faible, perte de spécificité trop grande.

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7
Q

Décrire les étapes de l’identification à l’aide de sondes ADN et ce qui venait avant un peu aussi

A

So la on a des plages de lyse sur pétri qui est rempli d’ADNr provenant des phages recombinant.
1. Dénaturation (si ADN double brin)
2. Préhybridation (on sature avec de l’ADN exogène notre ADN sur tout le pétri pour que quand on fasse hybridation nos sondes aillent just sur la séquence voulue.
3. Hybridation (sur filtre nitrocellulose)
4. Nettoie filtre pour enlever excès sondes non hybridés
5. Rayons X.

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8
Q

Comment s’effectue le marquage d’une sonde et quelles sont les 6 techniques de marquage? ET au final c quoi qu’on fait toujours après ces marquages là?

A

Soit radioactif P sur nuclé ou DIG-11-NTP.
Quand sont ajoutés par polymérase= marque.

  1. random primed: ssDNA+ random primers + DIG-dNTP + enzyme= sonde dsDNA marqué de DIG partout
  2. MARQUAGE PAR PCR: ssDNA+ specifif primers + TAQpoly+ DIG-dNTP= same que 1.
  3. Nick translation: dsDNA+ poly1 + DNAse (fais des trous dans ADN de sonde et poly ajoute ensuite) + DIG-dNTP= same que 1,2
  4. marquage en 3’ avec additition 50aine nu: sonde+ terminale transférase + ATP+ DIG-dNTP (marque queue poly A reliée à la sonde)
  5. marquage 3’ unique: meme affaire que avant mais utilise DIG-ddNTP donc juste un peu s’accrocher au bout de sonde.
  6. Sondes ARN: l’expliquer dans un autre question

Au final, faut toujours mettre l’anticorps après pour que ca se lie au DIG et produise détection (colorimétrie, lumière, fluo…)

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9
Q

C’est quoi DIG et comment ça marche pour le marquage?

A

morceau supplémentaire à un nucléotide qu’on ajoute et qu’un anticorps peut se lier. Il se lie et l’anticorps est lié à une enzyme un facteur fluorescent quelconque.

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10
Q

Expliquer le fonctionnement des sondes ARN et pk c plus facile et sauve des étapes

A

Se fait avec un plasmide.
1. on le linéarise
2. Doit avoir un promoteur T3/T7 devant le gène qu’on veut en sonde ARN
3. on met DIG-NTP + ARN poly
4. L’ARN poly va spécifiquement transcrire le gène en aval de T3/T7 avec des DIG-NTP.
5. T’as un ARN sondé

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11
Q

On peut aussi faire des oligonucléotides à partir d’une séquence de prot ou peptide (inverse de d’hab). Comment on fait. décrire les étapes.

A

Mettons on se rend compte que dans patient malade cette prot est tjrs+ exprimée.

  1. machine génère toutes possibilités de codons pour séquence
  2. on fait des sondes marquées pour chaque possibilté
  3. on trouve à peu près c ou le gène
  4. on met sondes mais ++ stringence pour que juste la bonne combinaison de codons trouvée s’accroche à 100%
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12
Q

Défintion du polymorphisme:

A

Variation entre les humains des séquences d’ADN à l’extérieur de nos gènes.

Ex: si on fait Sblot de génome de diffs personnes, fait bandes génomiques diff.

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13
Q

comment fonctionne l’analyse de gel d’électrophorèse

A

La distance en log est proportionelle au poids moléculaire. + lourd - migre vite.
Migre vers le bas car ADN -
Molécules intercalantes: s’insère dans l’ADN et donne couleur sur le gel.

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14
Q

Dire la fonction et décrire la technique de clonage positionel (marcher sur le chromosome)

A

Fonction: séquencer le génome

  1. tu coupes ton génome partiellement
  2. mets les fragments dans plasmides
  3. différentes colonies poussent, chacune contenant un fragment précis
  4. tu prends fragment d’une colonie A et essaie de faire chevaucher avec ceux des autres.
  5. Si chevauche, sonde crée marquage.
  6. Prends fragment colonie B et essaie de chevaucher ainsi de suite till séquencage complet.
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15
Q

Quoi faire dans une électrophorèse pour t’assurer que ta sonde donctionne bien?

A

Tu te fais un témoin avec la sonde et sa séquence complémentaire et checke si ça fait marquage.

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16
Q

À cause du… ça se peut qu’une ENZ de R coupe pas à la même place chez différentes personnes

A

polymorphisme

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17
Q

Expliquer le concept du loading control et son utilité

A

en prenant une protéine qui est partout égale dans cellule, ex Bactine, on peut voir entre les résultats si on a bien fait manips. normalement densité de la bande devrait être la même entre les échantillons,.

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18
Q

le génome de souris contient deux gènes différents qui codent pour de l’insuline. Combien de bandes on va voir dans un Nblot, Sblot et Wblot pour de l’insuline et pk?

A
  1. Nblot: 2 bandes diff car deux gènes diff et donc 2 ARN
  2. Sblot: même chose que Nblot
  3. Wblot: juste une bande car l’insulne faite à partir des 2 gènes se ressemble. c de l’insuline.
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19
Q

Décrire comment séquencer l’ADN par la méthode de Sanger par marquage P32 et ses limitations

A
  1. 4 réactions diff avec chacune un des nucléotide ddNTP, des primers, DNA poly et dNTPs.
  2. Quand ddNTP est ajouté, ça stop la poly.
  3. On fait migrer sur un gel acrylamide en 4 colonne, une pour chaque ddNTP (ATGC).
  4. On lit de bas en haut les bandes et on écrit à quel nucléotide inverse que ça correspond
  5. On a la séquence de l’ADN un brin original.

Limitations: La résolution des bandes est mauvaise. Pas plus de 200-300 pB ADN séquençable.

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20
Q

Décrire comment séquencer l’ADN par la méthode de Sanger par marquage de sonde fluorescente est plus développée que celle par P32

A
  • Machine est sous le gel et détecte la fluorescence selon chaque nucléotide qui élu jusqu’au bout: MEILLEURE RÉSOLUTIO
  • Peut séquencer jusqu’à 1kB
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21
Q

Quelle est la meilleure technique de séquençage à ce jour? Comment fonctionne-t-elle?

A

Par pyroséquençage. voir p. 108 à 110. C’est super bien expliqué.

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22
Q

Comment fait-on pour trouver ou sont les gènes dans le génome une fois qu’on l’a séquencé?

A

L’ordi analyse la séquence selon les 6 cadres de lecture possible pour trouver des cadres de lecture ouverts (ORF) qui indiquent la présence de gènes. Ça regarde les codons d’initition ATG et codon terminaison TAA/TAG/TGA.

Un fois les ORF possibles trouvés, on regarde pour TATA box, introns, promoteurs dans cette région .

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23
Q

D’ou la TAQ DNA poly provient?

A

trouvée dans bactérie Thermus aquaticus

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24
Q

À quoi sert la PCR?

A

Détecter mais surtout amplifier les séquences d’ADN qu’on a. Amplifier notre matériel génétique

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25
Q

Qu’est-ce qu’on fait avec les primers si on connait pas la séquence qu’on veut amplifier par PCR?

A

On ajoute des ‘adaptateurs’ aux extrémités 5’ 3’ de notre séquence (fragments d’ADN qu’on connait) pour pouvoir ensuite ajouter des primers complémentaires à ces adaptateurs dessus et faire la PCR.

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26
Q

Décrire les étapes de la PCR

A
  1. Séparer les 2 dsDNA (dénaturation 95oC)
  2. Hybridation des amorces à T variantes selon %GC. Plus on monte T, plus ça va être juste les amorces qui vont s’accrocher à 100%
  3. Élongation à 72oC (T optimale pour Taq poly)
  4. Répète des cycles
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27
Q

C’est quoi la RTPCR

A

Reverse transcripate PCR: à partir d’ADNc par la transcriptase inverse. On le fait avec la technique de Real time PCR en utilisant SYBR Green ou TaqMan

28
Q

Cleat quoi la technique du real-time PCT et comment on fait pour quantifier (2)?

A

C’est lorsque tu quantifies l’ADN de ta PCR en même temps de la faire par l’utilisation de couleur, fluorescence et luminescence.

2 techniques principales:
1. SYBR green: molécule intercalante qui si + ADN -> + luminescence donc + capte.

  1. TaqMan principe: permet de savoir aussi si gène est muté. PCR mais en ajoutant une 3e amorce qui si est clivée, elle crée lumière. Donc si mutée, s’accroche pas et pas création de lumière. Si pas muté, création de lumière. Peut aussi être l’inverse que l’amorce s’accroche à séquence mutée…
29
Q

Faire des exercices sur les cartes de restriction

A
30
Q

À quoi sert la mutagenèse dirigée et comment elle fonctionne?

A

Créer des mutations dans un gène dont on connaît la séquence (sauvage) aux niveau de sites spécifiques (gène).

C’est de l’essai erreur.

31
Q

Quelles sont les différentes méthodes de mutagenèse in vitro dirigée. Quels sont les résultats et le but de faire ça.

A

A) mutagènese dirigée par oligonucleotide: oligo se lie à ssDNA

  1. Paire base substitution: change juste un nucleotide par une amorce avec un nu muté, polymérisation, réplication de bactérie. Résultat: 50% plasmide muté et 50% sauvage.
  2. Insertion “ “
  3. Délétion “ “

B) sur ADN double brin:
1. RE enlève et on met séquence mutée
2. Délétion: RE, se referme
3. Plusieurs délétions: érosion par nucléases
4. PCR mutagenèse
But: changer séquence pour changer au mieux des prots mettons

32
Q

C’est quoi un SNIP

A

site polymorphique

33
Q

C’est quoi le RFLP? Et comment on les identifie?

A

C’est des fragments de restriction qui ont des longueurs différentes à cause de sites polymorphiques dans l’ADN.

On les identifie en crissant des sondes sur des fragments de sites de restricition, on coupe et on fait Sblot. Si pas même hauteur = y’a un site polymorphique.

34
Q

Quelle est l’importance des RFLP? (2)

A
  1. Permet de faire des liens génotypiques entre des individus = aide à déterminer la position de gènes intéressants.
  2. Permet de déterminer si quels locus mutés d’une maladie cause réellement la maladie (ça réduit l’air de recherche de savoir sur quel locus travailler)
  3. Peut être utilisé pour mesurer la diff génétique entre les populations.
35
Q

Parler de la diapo 240 à gab/anabelle car je comprends pas.

A
36
Q

C’est quoi les CMH et pourquoi c’est un exemple majeur de polymorphisme?

A

CMH: molécules présentatrices d’antigènes à surface des Cell.

Pourquoi? C’est constitué de 15 diff gènes +++ polymorphiques. Cause de problèmes de greffe.

37
Q

Faire la différence entre la génétique classique et la génétique inverse

A

Classique: Tu as maladie et essaie de trouver le gène mutant/protéine

Inverse: Trouve un gène et tu veux savoir à quoi ça sert donc tu le modifies pour voir si des phénotypes apparaissent

38
Q

Définition organisme transgénique

A

organisme contenant de l’ADN étranger (transgène)

39
Q

Qu’est-ce qu’un knock out dans la génétique inverse et son utilité?

A

C’est l’inactivation d’un gène en remplaçant par recombinaison homologue un bout par une séquence de marquage (ex: R à un antiobio ou GFP)

Utilité: Savoir à quoi le gène sert (observe si phénotype apparait)
** On peut remplacer juste certains exons

40
Q

Expliquer c’est quoi un vecteur d’expression en 2 étapes et à quoi ça sert dans l’exprimation d’un gène eucaryote dans des bactéries. EXEMPLE DE FACTEUR COAGULATION VIII

A

Exemple avec facteur coagulation VIII
On veut le produire dans des bactéries

Tu prends une bactérie et insère deux choses dedans:
1. Un chromosome recombinant pour: le gène de T7 ARN poly avec un promoteur inductible pour controler sa production bactérie. (ex: promoteur lac)
2. Un plasmide recombinant pour: le facteur VIII avec le promoteur de T7 ARN poly devant= quand IPTG= turn on la production de facteur VIII parce que T7 est produite.

Utilité: On s’assure que le gène pour notrev vecteur d’expression puisse être mis on/off pour pas causer une production infinie et causer lyse.

41
Q

Donner l’exemple de comment le gène de l’insuline humaine est exprimée dans les bactéries.

A
  1. On a 2 bactéries diff
  2. On insère plasmide recombinant avec un promoteur devant un gène codant pour Bgal et chaine A de l’insuline
  3. On fait de même dans la 2e B mais avec chaine B insuline
  4. Culture bactérienne
  5. purifie grâce à anticorps de Bgal
  6. on clive la chaine de Bgal/insuline et on lie ensuite les deux chaines A B de d’insuline pour faire la prot complète.
42
Q

C’est quoi une peptide signal et à quoi ça sert?

A

C’est une séquence d’un peptide qu’on ajoute devant un gène d’un prot recombinante.

Ça sert à ce que quand la prot est traduite, elle soit excrétée par exocytose. Juste besoin de récupérer le surnageant. Pas besoin de lyser!!!

43
Q

Quelles sont les 5 méthodes possibles d’insérer l’ADN recombinant dans les Cell eucaryotes pour la thérapie génique?

A
  1. Transformation
  2. Transfection: liposomes miment membrane et se font gober par endocytose
  3. Injection
  4. Injection virale (virus n’ayant plus le gène de reproduction)
  5. Bombardement tungstène: ADN et métaux rentrent ensmeble

Avantages et désavantages pour chacun

44
Q

Quels sont les avantages de se servir de la levure pour faire du génie génétique au lieu des plasmides bactériens

A
  1. Levures possèdent plasmide aussi de 6,3Kb
    **2. les chromosomes artificiels de levure peuvent atteindre 1000Kb
45
Q

Qu’est-ce que la techologie tet-on chez les levures? Expliquer le fonctionnement.

A

Même principe que vecteurs d’expression à 2 étapes chez B. On veut pouvoir mettre on/off

Dans le vecteur d’expression on a transactivateur Tet-on qui peut s’accrocher au promoteur et permettre la transcription du gène juste lorsqu’il est lié à doxycyclin = active (on).

46
Q

Qu’est-ce qu’‘un gène rapporteur en génie génétique? Donner un exemple pour les drosophiles et les souris transgéniques.

A

Gène rapporteur: gène qu’on ajoute pour marquer l’animal transgénique

Drosophile: ajout gène B-gal bactérien avec un promoteur de choc thermique= si on donne X-gal quand choc thermique devient bleu car B-gal est produite

Souris: GFP ajoutée dans l’ADN recombinant.

47
Q

Dans la thérapie germinale, comment est-ce qu’on crée des organismes (ex souris) transgéniques à 100%?

A
  1. on retire des cellules du blastocyste
  2. On les rend transgéniques par insertion de vecteur recombinant qui devra faire recombinaison homologue
  3. On réinsert les Cell que ça a fonctionné dans embryon
  4. On obtient une chimère.
  5. On accouple la chimère avec un autre normal
  6. On accouple les deux enfants hétérozygotes pour notre KO
  7. On obtient un homozygote 100% pour notre KO donc 100% transgénique
48
Q

Qu’est-ce qu’une chimère?

A

Animal transgénique qui a une partie de ses cellules WT et une partie de cellules transgéniques.

49
Q

C’est quoi un site loxP et nbr pB? D’ou ça vient?

A

Site spécifique dans l’ADN de 34 pb qui indique à la CRE (ADN recombinase) ou couper. Vient de bactériophages.

50
Q

Au cours de la fabrication d’une souris transgénique knock out, il y a trois possibilités de résultat. Quels sont-ils, lequel est le bon et comment on fait pour le sélectionner? Combien d’allèles du chromosome sont affectés?

A

Quand on insère le vecteur recombinant dans les Cell souches, 3 choses possibles:

  1. Pas de recombinaison homologue. Cell reste Neo(s) et tk- +++souvent
  2. Insertiom mais sur le mauvais site. Neo(R) et tk+ + souvent
  3. Recombinaison homologue. Neo(R) et tk- . survient rarement

Sélection: Ajout de neomycin et de Ganciclovir. Neomycin tue #1 et ganciclovir tue #2. Reste juste celles qui ont fait RH sur UN ALLÈLE SEULEMENT

51
Q

C’est quoi la tk dans la fabrication d’une souris transgénique avec knock out?

A

C’est une thymidine kinase. Elle ajoute PO4 sur ganciclovir qu’on ajoute et l’empèche d’être utilisée comme base analogue = la cellule ne peut se répliquer/faire prots et meurt.

52
Q

Comment faire pour qu’un knock out soit juste dans un tissu/organe précis grâce au système CRE/LOX?

A

On prend 2 souris:
1.Dans une on a ajouté par plasmide dans cell souche du blastocyste gène CRE en AVAL d’un promoteur spécifique à un tissu (exemple promoteur progestérone)

  1. Dans l’autre on fait pareil mais on met des sites LoxP autour du gène qu’on veut knock out.

3.On les croise pour avoir souris ayant un allèle LoxP et l’autre CRE= KO du target gene.

53
Q

C’est quoi la CRE dans le système CRE/LOX?

A

Cyclization REcombination code pour une ADN recombinase qui est une RE qui coupe juste aux sites LoxP

54
Q

Qu’est-ce qu’un knock in?

A

On remplace le gène de la protéine sauvage par le gène mutant. On retire pas on remplace.

55
Q

Comment est-ce que on fait pour au niveau du génie génétique pour augmenter la croissance des saumons qu’on élève.

A

On met le gène de croissance sous le contrôle d’un promoteur fort ( s’active facilement) à métaux lourds. Donc on les nourrit avec des métaux lourds mélangés et boum.

56
Q

Définir la thérapie génique somatique

A

correction d’un phénotype par le traitement de quelques cellules somatiques chez la personne atteinte: assez pour atténuer symptomes

57
Q

Quels sont les deux moyens les plus utilisés pour introduire un transgène dans les cellules? Lequel est le plus utilisé in vivo et in vitro?

A
  1. Virus : in vivo
  2. Liposomes : in vitro
58
Q

Quels sont les avantages et désavantages des lentivirus vs les adénovirus?

A
  1. Lenti
    Problèmes:
    -doit s’insérer dans génome de hôte =EFFETS MUTAGÈNES
    -S’attaque juste aux Cell de prolifération
  2. adéno:
    Avantages:
    -ne s’intègre pas dans chromosome de hote
    - attaque tous types de Cell
59
Q

Comment est-ce qu’on fait la première thérapie génique ayant eu du succès en 1990? Quelle était la maladie? C’est quoi des LTR?

A

GB fonctionnent mal à cause de mutation du gène de l’ADA (adénosine désaminase)

On créé un rétrovirus recombinant avec l’ADA normal, un promoteur fort (SV40), gène de Neo(R) pour sélection et tout cette séquence flanquée de LTR (stabilise)é

On insère le virus et ben succès.

LTR: séquences ADN reconnus pour pouvoir être intégrées dans la génome infecté.

60
Q

Quelles sont les deux approches de thérapie génique contre le cancer?

A
  1. Remettre P53 normale
  2. Empêcher les ARN oncogènes (comme AKT) d’être traduits en prots = thérapie génique anti-sens
61
Q

C’est quoi une thérapie génique anti-sens et comment ça fonctionne? Expliquer en prenant oncogène XIAP comme exemple.

A
  1. C’est qu’on empêche l’ARN d’être traduite en prots en y collant un brin complémentaire. Rend un gène silencieux
  2. On insère dans Cell cancéreuses avec un vecteur le gène de la prot mais à l’envers (PAIX au lieu de XIAP)
  3. Donc, Cell produit ARNm de XIAP mais aussi PAIX, les deux se collent par complémentarité
  4. prot Dicer clive les dsARNm en fragments 21-23 nucleotides appelés siRNA.
  5. Complexe protéique RISC reconnait les siRNA et les clive
62
Q

Qu’est-ce que les séquences CRISPRS chez les bactéries et leur fonction?

A

Ce sont des signatures d’infections virales (mémoire d’infections passées)

Fonction: Mécanisme de défense contre virus ayant déjà infecté la bactérie

63
Q

Comment fonctionne le système de défense CRISPR chez la bactérie?

A

En transcriptant les séquences CRISPR lors d’infection, l’ARN se lie à enzyme CASP9 et sert de guide. l’ARN est une séquence complémentaire de 20 nucléotides à celle du virus. S’y lie et permet à CASP9 de cliver l’ARN/ADN intru.

64
Q

Quels sont les avantages de la technologie CRISPR-CAS9?

A

On peut aller sur le génome précisément ou on veut grâce à l’ARNguide. Risques réduits de mutagénèse.

65
Q

Nommer 4 façons dont on peut se servir de CRISPR-CAS9 pour altérer le gène Ins1 de l’insuline.

A
  1. Knock out du gène de l’insuline
  2. On fait un knock out mais en insérant GFP pour faire la sélection.
  3. Faire de la mutagénèse dirigée.
  4. On active un gène précis avec CAS-9 mutée. Elle peut pas cliver, juste s’accrocher. On la fait se lier à un promoteur= gène toujours exprimé!
66
Q

C’est quoi les FAS? Que se passe-t-il si en trop grande quantité? Comment on peut traiter?

A

C’est des prots impliquées dans activation de la mort CellR

Si trop de prod= cause fibrose du tissu

Thérapie anti-sens= baisser mort cellulaire

Bio Mol Med (2 decks)

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