DNA Flashcards
¿qué estructura de DNA tiene giro contrario al normal y qué dirección es esa?
DNA Z, levógiro
Purinas
Adenina
Guanina
dos anillos
efecto hipocrómico DNA
disminución en la absorbancia de la molécula cuando las bases están apiladas en doble hebra
¿por qué en PCR es importante identificar la Tm del primer con la hebra parental también?
porque es necesario saber los rangos de T en los que se puede trabajar, pues si no se baja lo suficiente la T, es posible que no hibride el partidor con la hebra parental ¿?
¿cómo afecta la fuerza iónica a la Tm?
a medida que aumenta la fuerza iónica -la concentración salina-, incrementa el valor de Tm pues se necesita más energía para desestabilizar los puentes de hidrógeno pues la estructura se hallaba estabilizada por las sales¿?
hibridación selectiva
es el fenómeno de apareamiento entre hebras individuales de DNA con cierta identidad mínima tolerada, esto último implica la selectividad
se controla a través de la astringencia
fórmula cálculo Tm en solución sin sal
T°m = 69,3°C + 0,41 (% G + C)°C
¿por qué los viruses tienen más CG%?
porque tienen el genoma más compactado y la secuencia de los genes tiende a ser alta en CG, mientras que AT es más de codones de término
sal más usada en hibridación
SSC
standard sodium citrate
Fórmula para obtener el % de identidad tolerable de acuerdo a los grados bajo Tm
100% - (°C bajo Tm/(1.4°/%)) = % identidad suficiente
¿Cómo es el sobreenrrollamiento del DNA in vivo?
1 s.e negativo (en contra de la helicidad) cada 200 bp
Orden de DNA (arriba hacia abajo) en gel de acuerdo al sobre enrollamiento
Migra menos - DNA circular relajado - DNA lineal - DNA sobre enrollado neg% Migra más
DNA linker
Sección de DNA eucariótico accesible porque se halla entre dos núcleosomas
Histona H1
Histona de DNA linker que permite cambiar el ángulo de salida del DNA desde el nucleosoma, de tal manera que permite formar una hélice en sí mismo
DNa de 10 nm vs 30 nm
10 nm es más laxo, collar de perlas
30 nm es más condensada, hélice de nucleosomas (H1)
¿Cuál es el menor tamaño de DNA que corta una nucleasa y why?
200 nts, porque la nucleasa solo corta el DNA linker, y cada nucleosoma tiene 200 nts de largo en las dos vueltas que da a las core histonas
Ahora, si la digestión es ctte, podemos llegar hasta 140 nts (nucleosome core) porque la nucleasa eventualmente consigue llegar a la parte más externa del nucleosoma
¿Cómo se sobre enrolla el DNA que no es circular?
Con proteínas fijas en los extremos del DNA, y con histonas ¿?
- Enzima que forma primers
- Enzima que los quita
- Enzima que los reemplaza
- Primasa (RNApol)
- RNAsa + 5’ exonucleasa
- DNApol + DNA ligasa
¿Cómo se crea y mantiene la burbuja de replicación?
Se crea a partir de la apertura del nucleosoma, que deja laxa un area sin twists, pero además la helicasa la mantiene abierta separando los pdH entre bases (tiene polaridad de 5’ a 3’ tb, por ende se enrolla al rededor de la hebra retrasada)
¿Cómo se separan los dos anillos enlazados después de replicación bidireccional de DNA circular?
Mediante un corte doble hebra con Topoisomerasa II
¿Why es necesario hacer PCR y amplificar DNA?
Porque así no aseguramos de que estamos manipulando el DNA correcto, ya que la amplificación nos permite ver (gel electroforesis) las moleculas
¿Qué puedo hacer con el DNA amplificado?
Clonación, análisis electroforesis, secuenciación, usados como sonda
Fingerprint DNA
Utilización del DNA como marcador identificatorio en forénsica, a través de la amplificación del DNA de la muestra y su posterior digestión con enzimas de restricción que dejan bandas de DNA en electroforesis características para esa secuencia
RNAsa H en PCR de Covid-19
Control positivo que permite concluir que se ha extraído suficiente cantidad de RNA como para identificar el virus
¿Cuál es la limitación de tamaño de DNA que se puede replicar x PCR y de qué depende?
Hasta 20k nts
Por la procesividad de la polimerasa y la cantidad de nts que puedo poner en la sln
¿Por qué es importante usar primers convergentes en PCR?
Porque esto me permite aumentar progresiva y exponencialmente la cantidad de DNA templado a la cual se podrán unir los partidores, además de que así no existe hebra retrasada y permite amplificar sólo la sección de DNA que flanquean los partidores creados
Componentes reacción PCR
- buffer pH 8.2 con Mg++
- dNTPs
- Taq DNApol
- DNAtemplado
- 2 primers que flanquean
T óptima, velocidad promedio y tasa de error Taq DNA pol
72°C
1 Kb/min
1-2 / 10^4 pb
¿A qué T se debe hacer el melting y el annealing de primers during PCR?
Melting por sobre la Tm del templado (94°C)
Annealing bajo la Tm de primers con templado (50°C)
¿Why 30 ciclos de PCR?
Es lo que permite llegar a máximo del producto antes de que se sature porque se acaban los primers y la cantidad de NTPs que podía añadir
¿Qué tengo que hacer post PCR si quiero usar el DNA amplificado para clonar?
Secuenciarlo y clonarla en bacterias a través de plasmidios, para obtener más copias sin mutaciones
¿Cómo hacer un cálculo del error del PCR que realicé?
Mediante un test in vivo amplificando lacZ como marcador
¿Qué factores aumentan la tasa de errores en PCR?
Mayor [] de Mg y de dNTPs
¿Cómo evitar problemas de sensibilidad con el PCR?
- siempre tener control positivo y neg
- usar reactivos y condiciones optimas
- sector dedicado, puntas con filtro, etc (prolijidad de manipulación)
Condiciones que haya que considerar al hacer primers (8)
- convergentes
- secuencia única
- de 17 a 25 nt
- no inter ni intracomplementariedad de + de 3 bp
- el extremo 3’ debe ser C o G
- %C/G al rededor de 50% (min eso)
- Tm de ambos primers debe ser sobre 50°C pero hasta 65°C no más (o 5°C bajo melting)
- Dif de Tm de no menor de 5°C
Cantidad de nts accesibles x surco mayor
4-5
distancia entre pares de nts y por giro
3.4 A entre nts Por lo tanto 34 por giro ya que son 10 nts c/u
proteoma definición
Es la totalidad de proteìnas expresadas en una célula particular bajo condiciones de medioambiente y etapa de desarrollo (o ciclo celular) específicas, como puede ser la exposición a un estímulo. Es aproximadamente, el equivalente proteico del genoma.
