Brainscape's Knowledge GenomeTM


Top Flashcards (Certified)
All Flashcards

moleculaire biologie > Deel A: hoofdstuk 3 > Flashcards

Deel A: hoofdstuk 3 Flashcards

Technieken

1
Q

Hoe cellen openbreken om DNA te isoleren?

A

Cellyse = homogeniseren van monster
Verschillen in celarchitectuur vereist verschillende lysismethoden (andere voorbehandeling nodig)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Welke verschillende lysis worden er gebruikt?

A
  1. Chemische stoffen die celwand afbreken
  2. Biologische (enzymen)
  3. Fysisch: temperatuur, osmose
  4. Mechanisch: homogeniseren, mortier
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Situeer detergent (+voorbeeld)

A

Chemische lyse
bijvoorbeeld SDS; heeft hydrofiel en hydrofoob gedeelte => maakt celmembraan kapot
- integratie tussen fosfolipiden = vormt micellen
- hydrofoob effect (aantrekkingskracht): apolaire stoffen aggregeren in waterige oplossing & sluiten watermoleculen uit

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Situeer chaotroop reagens (+voorbeeld)

A

Chemische lyse
bijvoorbeeld GuSCN, ureum, GuCl, fenol, ethanol; brengt chaos in cel, verhoogt entropie door te infereren met (zwakke) intermoleculaire krachten zoals H-bruggen, Van der Waals krachten en hydrofobe effecten
Verbreekt watermantel rond DNA, denaturatie eiwitten, verhogen membraanpermeabiliteit door verstoring hydrofoob effect

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Situeer alkalische buffer (+voorbeeld)

A

Chemische lyse
Bijvoorbeeld NaOH: verzeping van vetzuren

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Situeer Proteïnase K

A

Biologische enzymatische lyse
Breekt EW, celmembraan EW en EW gebonden aan nucleïnezuren af, ook bij detergenten
Wordt niet gedenatureerd door detergent, want detergent ontrolt DNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Situeer lysozyme

A

Biologische enzymatische lyse
Hydrolyseert peptidoglycaan, breekt celwand van gram+ open

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Voorbeelden biologische lysis

A

chitinase (plantencel)
cellulase (plantencel)
Proteïnase K
Lysozym

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Methodes om DNA te zuiveren en overige componenten te verwijderen

A
  1. fenol/chloroform extractie
  2. isolatie dmv silicakolom
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Voordelen en nadelen fenol/chloroform extractie

A

+ zeer zuiver DNA, hoge opbrengst
- schadelijk solvent, tijdrovend, niet geautomatiseerd, ervaren laborant nodig

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Hoe gebeurt fenol/chloroform extractie?

A

met waterige, organische en interfase
De dichtheid van Fenol > dichtheid water

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Wat zijn de drie stappen bij isolatie dmv silicakolom?

A
  1. adsorptie DNA op silicagel: bindingsbuffer
    hoge zoutconcentratie en chaotroop reagens: verwijdert watermantel + vormt kationbrug tussen silicakolom en negatief geladen DNA
  2. verwijderen contaminanten: wasbuffer
    ethanol en hoge zoutconcentratie: DNA blijft gebonden aan kolom, contaminanten weggewassen + verwijderen enzyminhibitoren
  3. elutie van DNA (eluaat): elutiebuffer
    lage zoutconcentraite: watermantel rond DNA en silica => DNA elueert
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Wat is een voordeel van isolatie dmv silicakolom?

A

Snel, minder schadelijk, zuiver en geconcentreerd DNA, makkelijk automatiseren

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Normaal zuiver DNA profiel

A

A260/A280 tussen 1.8-2.0
A260/A230 hoger dan 1.8

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Wat betekent absorbantie bij 230, 260 en 280 nm?

A

230: veel organische solventen, zouten
260: DNA, RNA door aromatische N-basen
280: proteïnen, fenolen, EW

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Wat is denaturatie?

A

DS DNA –> SS DNA door temperatuurstijging, ongunstige pH (OH-), H-bruggen afgebroken

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Wat is renaturatie?

A

SS DNA –> DS DNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Wat is de smelttemperatuur?

A

temperatuur waarbij de helft van DS DNA gedenatureerd is en dus SS DNA is

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
19
Q

Smelttemperatuur is afhankelijk van?

A
  • G-C of T-A: G-C heeft 3 h-bruggen en heeft hogere temperatuur nodig om af te breken
  • lengte DNA: korte stuk gaat makkelijker
  • ionensterkte van oplossing: veel zout = helix stabiel dus concentratie Na stijgt
    Hoe meer zout, hoe stabieler en hoe hoger de temperatuur
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
20
Q

Wat is een oligonucleotide probe?

A

stuk DNA of RNA complementair aan specifiek DNA fragment dat opgespoord moet worden. Kan obv nucleotidesamenstelling hybridiseren met specifiek DNA/RNA fragment

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
21
Q

Wat is stringentie?

A

reactiecondities waaronder hybridisatie plaats vindt, soort strengheid

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
22
Q

Wat betekent hoge/lage stringentie?

A

hoge: alleen exact complementaire DNA-strengen binden
lage: strengen met een aantal mismatches kunnen nog steeds binden

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
23
Q

Verklaar mismatch

A

= kruishybridisatie = sommige tegenover elkaar liggende basen zijn niet complementair en vertonen geen baseparing

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
24
Q

Verklaar match

A

alle basen van de probe hybridiseren met de target

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
25
Stringentie wordt beïnvloedt door;
1. temperatuur: hoe hoger temp, hoe hoger stringentie 2. zoutconcentratie: hoe hoger zoutconcentratie, hoe stabieler en lager de stringentie 3. pH: extreme pH heeft hogere stringentie
26
Factoren die stabiliteit van heteroduplexen beïnvloeden;
1. probeconcentratie: hoge conc, beter signaal maar kans op aspecifieke binding stijgt 2. temperatuur: hoe hoger, hoe specifieker 3. zoutconcentratie: hoe hoger, hoe hoger de temp 4. aanwezigheid denaturerende stoffen (bv formamide): hoe hoger DS conc, hoe meer H-bruggen verbroken, hoe lager Tm
27
Eigenschappen hoge stringentie
1. lage probeconcentratie 2. lage ionensterkte 3. hoge temperatuur 4. zwakker positief signaal, lage achtergrond
28
Eigenschappen lage stringentie
1. hoge probeconcentratie 2. hoge ionensterkte 3. lage temperatuur 4. sterker positief signaal, hogere achtergrond
29
Wat is amplificeren?
snel exponentieel vermeerderen van DNA/DNA-fragment = PCR
30
Waarom pcr?
1. preparatief: bereiding DNA-fragment 2. analytisch/diagnostisch: aantonen aanwezigheid bepaald DNA-fragment - opsporen genetische aandoening - opsporen ziekteverwekker (virus, bacterie, parasiet) - opsporen genetische verwantschap van verschillende organismen
31
Principe PCR
1. denaturatiefase: DS --> SS DNA smelt, beide strengen gaan uiteen 2. annealingsfase: RNA primer zet 3' uiteinde erop Primers hybridiseren en vormen start voor DNA-synthese 3. extensie/elongatie: keten verlengen
32
Componenten nodig bij PCR
DNA template, DNA-polymerase (thermostabiel), 2 primers, nucleotiden (dNTPs), buffer met MgCl2, DNAse vrij water
33
Wat is een amplicon
Gevormde producten van PCR
34
Bespreek denaturatiefase
beide strengen toegankelijk maken voor DNA-polymerase => verbreken H-bruggen tussen baseparen - initiële denaturatiestap duurt 2min - denaturatie tijdens cycli duurt 1min
35
Bij welke temperatuur gebeurt de denaturatiefase?
94°C
36
Bespreek annealingsfase
specifieke forward en reverse primers annealen (hybridiseren) met complementaire sequenties van gedenatureerde target DNA
37
Bij welke temperatuur gebeurt annealingsfase?
45-60°C
38
Wat is het startpunt bij synthese (annealing)
3'OH
39
Wat is belangrijk bij annealing?
de annealingstemperatuur - te hoog: inefficiënte hybridisatie - te laag: aspecifieke primer binding
40
Bespreek elongatiefase
Nieuw DNA gesynthetiseerd van 5' naar 3' met nucleotide template De duur van deze fase is afhankelijk van lengte amplicon en gebruikte DNA-polymerase
41
Bij welke temperatuur gebeurt extensiefase?
72°C
42
Waar verloopt PCR
In thermocycler met thermoblock en verwarmd deksel tegen verdamping
43
Wat zijn dNTPs, wat gebeurt er bij te hoge/lage concentratie?
bouwstenen van DNA, mengsel met gelijke hoeveelheid van elk nucleotide te hoog: fouten worden ingebouwd in keten te laag: synthesesnelheid van polymerase daalt
44
Welke primer bindt op welke streng?
- forward primer bindt aan 3'OH van antisense/non-coding/template streng sequentie identiek aan 5'uiteinde van sense streng - reverse primer bindt aan 3'OH van sense/coding/non-template streng sequentie identiek aan 5'uiteinde van antisense streng
45
Hybridiseren specifiek met complementaire sequentie; de specificiteit van reactie wordt bepaald door?
1. complementariteit aan template 2. primerlengte 3. sequentie primers 4. annealingstemperatuur 5. concentratie
46
Wat gebeurt er als de concentratie van primer te hoog of te laag is?
te hoog: aspecifieke binding, ongewenste PCR producten (bv primer-dimeren) te laag: PCR-efficiëntie daalt
47
Functie en definitie primer
= oligonucleotiden, kort stukje enkelstrengig DNA als startpunt van DNA-synthese
48
Bij keuze van DNA-polymerase moet er rekening gehouden worden met;
1. halfwaardetijd 2. synthesesnelheid 3. proofreading activiteit
49
Bespreek Taq DNA polymerase
- thermostabiel: 70°c optimaal - vaak sticky end additie van 1 adenosine aan 3'OH (helpt bij richting bepalen) - geen 3' naar 5' exonuclease eiwit = geen proofreading - Mg2+ als cofactor
50
Leg de 3 activiteiten van DNA-polymerase uit
1. 5' naar 3' DNA polymerase: tijdens annealing en elongatie worden nucleotiden complementair aan DNA template ingebouwd aan 3'OH aan uiteinde primer 2. 3' naar 5' exonuclease activiteit = proofreading; na inbouw wordt een niet correct ingebouwd nucleotide verwijderd en vervangen 3. 5' naar 3' exonuclease activiteit: tijdens synthese worden nucleotiden stroomopwaarts verwijderd
51
Bespreek buffer: definitie, voorbeeld, hoge/lage concentratie
Bijvoorbeeld: Tris-HCl, MgCl2 Detergent om DNA polymerase beter te doen werken concentratie beïnvloedt efficiëntie en specificiteit te hoog: enzym minder specifiek te laag: enzym minder actief
52
Bespreek inhibitoren bij pcr
remmende stof, kan aanwezig zijn voor zuivering bv bloed, ethanol, fenol/chloroform
53
Wat is DNA template, wat doet hoge/lage concentratie?
template, moet zuiver en niet-afgebroken zijn - grote overmaat: remt PCR efficiëntie en specificiteit - lage hoeveelheid vraagt extra optimalisatie
54
Wat zijn de 2 PCR controles?
1. negatieve controle: controleren of er geen contaminatie of ongewenste PCR-producten zijn 2. positieve controle: controle of PCR goed verlopen is technisch
55
Wat is NTC
No Template Control: alleen mastermix zonder template, spoort contaminatie op in mastermix
56
Geef 3 PCR toepassingen
Hot start PCR Touchdown PCR Nested PCR
57
Leg hot start PCR uit
DNA polymerase inactief (bv door binding antilichaam/wax) => door initiële hittestap wordt DNA polymerase geactiveerd om specificiteit te verhogen
58
Leg touchdown PCR uit
annealingstemperatuur niet constant, daalt tijdens aantal cycli => verhoogt specificiteit, meerdere amplicons amplificeren tegelijkertijd in zelfde toestel
59
Leg nested PCR uit
methode van 2 opeenvolgende PCR's bij moeilijk te amplificeren targets of lage beginconcentratie 1. PCR met outer primerset 2. PCR met inner primerset op geamplificeerd PCR product om specificiteit en efficiëntie te verhogen
60
Wat is een mastermix?
mengsel van alle PCR-componenten zonder DNA-template, voor meerdere stalen
61
Wat is een PCR-mix?
mengsel van alle PCR-componenten inclusief DNA-template
62
Principe elektroforese
1. negatief geladen nucleïnezuren worden mbv elektrische stroom in een matrix gescheiden volgens fragmentgrootte 2. de dichtheid van matrix kan gevarieerd worden zodat ook het scheidend vermogen gevarieerd kan worden
63
Wat zijn de voordelen en nadelen van PAGE?
+ resolutie is 1 bp - arbeidsintensief, niet geautomatiseerd, toxiciteit
64
Wat is het scheidingsgebied van PAGE?
5-2000 bp
65
Wat is de resolutie van AGE?
10-20 bp (laag)
66
Wat is het scheidingsgebied van AGE?
50-50000 bp
67
Wat zijn de voordelen en nadelen van CE
+ geautomatiseerd, snel, gevoelig, zeer hoge resolutie, digitale opslag van data - duur
68
Juist of fout? Hoe meer agarose, hoe groter de proiëngrootte.
FOUT, hoe kleiner de proiëngrootte.
69
Wat is genomics?
de studie van het genoom van model-organismen
70
Wat is sanger sequencing?
sequentiebepaling, eerste generatie sequencering adhv dideoxymethode; andere nucleotide gaan inbouwen = ddNTP => DNA fragmenten met ddNTPs aan 3'uiteinde die elk 1 nucleotide in lengte verschillen
71
Hoe verloopt sanger sequencing?
1. fragmenten worden gescheiden op lengte 2. elke ddNTP is gelabeld met eigen kleur waardoor elk DNA-fragment de kleurt heeft van de laatst ingebouwde base 3. analyse van fragmenten met CE in een elektroferogram

moleculaire biologie (3 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2025 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions