Cromotografias Flashcards
¿Que son las cromotografias?
Tecnica para separar componentes en una matriz
Se realiza en columnas con una resina, en la cual las moleculas son arrastradas por un buffer
¿Que es la cromotografia de filtracion en gel?
Separa las proteinas por tamaño, las proteínas pequeñas son retenidas por la resina por lo tanto salen al final y lo primero que comienza a salir de la columna son las proteínas más grandes que no pudieron ser adsorbidas por los poros del gel en cambio las proteínas más pequeñas salen al final de la corrida cromatográfica , cada resina o gel que se utilice tiene un determinado rango de fraccionamiento, es regulado por la gravedad o por una bomba que regule la velocidad de salida.
Dentro de los polímeros que se utilizan se encuentran derivados de azucares como: dextrano, agarosa y poliacrilamida.
Volumenes dentro de las cromotografias
Volumen total (VT): todo el volumen que ocupa el gel dentro de la columna VT= Pi x R2 x H
Volumen de exclusion (Vo): volumen que existe entre las particulas que estan dentro de la columna, el mas utilizado es el AZUL DE DEXTRANO
Volumen de la fase estacionaria (VS): volumen que ocupa la resina
VS= VT - Vo
¿Cual es el proposito de realizar una filtracion en gel?
Para limpiar una proteína, para separar de sus contaminantes, para eliminar componentes que haya utilizado la proteína, para asilar componentes de bajo peso molecular marcados, asilar cofactores inhibiciones o enzimas, para la eliminación de sales unidas a las proteínas o péptidos, purificación de macromoléculas y determinación del peso molecular de las proteínas.
¿Qué es el límite de exclusión?
Es el peso molecular MAXIMO sobre el cual las moléculas son separadas (excluidas) de la columna.
¿Rango de fraccionamiento?
son los valores máximos y mínimos de pesos moleculares en donde el gel puede separar las proteínas.
¿Volumen de elución (VE)?
El volumen especifico en donde salió cada proteína, volumen de la fase móvil que se necesita para que salga la proteína.
Cromotografias de afinidad
La resina es un grupo químico con el cual interacciona la proteína se crea una AFINIDAD. Se requiere un buffer adecuado, concentración de sal que permita la unión de la proteína a la resina y la elusión se hace con ligando libre para arrastrar por competencia a la proteína que quedo pegada a la resina (eluir) se utiliza el mismo sustrato (ligando libre) para eludir la proteína.
Cromotografias de intercambio ionico
Las particulas de la resina tienen grupos quimicos con cargas electricas, se clasifican en :
Carboximetil celulosa la cual es una resina con grupos carboxilos con carga negativa realiza intercambio catiónico
Dietil-amino-etil-celulosa en la cual la resina tiene partículas con carga positiva es decir, grupos aminos esta partícula realiza intercambio aniónico.
“Se asocian a particulas con cargas opuestas”
Se pueden eluir las proteinas adosas a la resina con un buffer con sal de 0 a 1.0 M
Electroforesis
Permite separar moléculas de cargas diferentes mediante la aplicación de un campo eléctrico, donde las moléculas migraran a los electrodos de polaridad opuesta en función de su tamaño (PM) carga y forma.
¿como es el mecanismo de accion de la electroforesis?
Separar por tamaño a través de una carga eléctrica por lo tanto, las proteínas MAS PEQUEÑAS avanzan más RAPIDO y las que son más grandes avanzan más LENTO.
Etapas de la electroforesis
- Se parte por un homogenizado, es decir, un extracto crudo
- Luego se realiza un fraccionamiento (precipitación) con sal
- Se realiza una cromatografía por intercambio
- Cromatografía de exclusión molecular o de filtración en gel
- Cromatografía de afinidad
Resultado: se obtiene una proteína pura
¿Cuales son las principales cromotografias?
Filtración en gel: se separa por tamaño las proteínas más grandes salen primero las intermedias se van retrasando y las más pequeñas salen al final va dependiendo de la columna, el rango de fraccionamiento.
Intercambio iónico: se utilizan partículas con carga iónica (positiva o negativa) se va a asociar a proteínas con cargas opuestas y se puede eludir con sal.
De afinidad: estas partículas tienen unido un grupo químico especifico que puede ser un sustrato o un ligando frente al cual la proteína se va a unir y se puede eludir con una mayor concentración de ligando LIBRE.
En condiciones ideales, ¿como debe ser la interaccion resina-muestra?
- La proteina no debe reaccionar con la resina
- A mayor longitud de la columna ocurre un mejor fraccionamiento de las proteinas
- La velocidad o flujo se regula con una bomba debe osilar entre los 2-10 cm/h
- El volumen de mezcla no debe exceder el 5% del volumen total
- La resina no debe tener grietas y debe ser homogenea
¿Que gel se requiere para la electroforesis de proteinas?
Gel de poliacrilamida
