Cours 9 - Clonage moléculaire Flashcards
Différence entre criblage génétique classique et criblage génétique inversé.
-> Criblage classique (en avant) :
- Identifier les gènes importants pour
un phénotype biologique (phénotype connu, gène inconnu)
- Milliers de gènes a la fois
- Générer des hypothèses
-> Criblage inversé :
- Sélectionner un gène et déterminer
les phénotypes associés (phénotype inconnu, gène connu)
- 1 gène a la fois
- Évaluer une hypothèse
Étapes du criblage génétique classique (en avant)
1 - Élaborer un test afin de mesurer le phénotype
• Simple
• Quantitatif
• Permettant de distinguer les animaux normaux de ceux qui ont un phénotype
anormal
• Souvent utilisé dans des organismes modèles (vers, mouches)
2 - Mutagenèse des oeufs/larves (on fait muter les gènes au hasard), types : chimique, irradiation, insertion
3 - Dépistage d’un phénotype anormal
• Après la production de 100-1000 lignées, chacune est évaluée
par un test phénotypique (celui choisit à l’étape 1)
• Les lignées avec phénotype sont maintenue
4- Test de complémentation
• Déterminer si les mutations identifiées sont uniques ou non par des croisements
• Méthode utilisée lorsque plusieurs mutant présente le même phénotype
5. Localiser le gène
• Analyse de liaison (chimique et irradiation), voit s’il est transmis en même temps (physiquement proche) qu’un autre gène connu
• Séquence du transposon (insertion)
6. Cloner le gène
• Identifier la séquence de l’ADN
Différents modes de mutagenèse (3) dans le criblage génétique classique, brève description et leurs avantages/ désavantages.
- > Chimique : provoque des mutations ponctuelles (un seul nucléotide)
- Les mutations peuvent être non sens, faux sens ou dans la séquence non codante (influencer l’épissage et les éléments régulateurs)
- Avantage : Permet de nombreuses mutations différentes au sein des régions géniques
- Désavantage : Difficile a cartographier (voir où la mutation s’est insérée)
- > Irradiation : provoque des ruptures dans l’ADN double brin
- Génère des grandes délétions ou réarrangements chromosomiques
- Avantage: Facile a cartographier par analyse cytogénétique
- Désavantage : Souvent pas limité a un gène unique. Pas approprié pour une analyse fine.
- > Insertion : contient un gène marqueur
- Peut s’insérer dans la région codante = perturbe la séquence d’acides aminés
- Peut s’insérer dans les régions non codante adjacente = perturbe l’ épissage ou l’expression du gène
- Avantage : Facile à cartographier dû au « transposon tag », stable
- Désavantage : Transposition secondaire possible. Ne s’applique à toute les espèces.
Qu’est-ce qu’on peut conclure avec un test de complémentation (criblage génétique classique)?
- on fait des croisements pour voir si le gène d’intérêt s’est inséré dans le gène connu
- si le phénotype est encore présent après le croisement, ça veut dire que les gènes sont liés
Quel est le principe de fonctionnement du criblage génétique inversé? Quelles méthodes peuvent être employées? (2)
Perturber un gène d’intérêt pour déterminer son rôle à partir de la variation des phénotypes
- > méthodes :
- knockout
- édition du génome
Méthode d’édition du génome par nucléase (criblage génétique inversé).
- fokl : une nucléase qui se lie au brin d’ADN à un endroit précis et qui le coupe (simple brin)
- CRISPR : nucléase recrutée à l’ADN via un ARN, liaison au site par appariement des bases, coupure double brin
Fonctionnement de CRISPR (pas dans les détails). Quelles sont les 2 issues de la coupure?
1 - un ARN de guidage dans CRISPR guide la nucléase à la séquence d’intérêt
2 - la nucléase coupe dans la séquence PAM, donc elle doit aussi reconnaître cette séquence
3 - quand CRISPR coupe, il y a 2 types de réparation qui peuvent arriver :
- NHEJ : recombinaison non-homologue, créer souvent une insertion ou une délétion, donc donne souvent knock-out
- HR : recombinaison homologue, permet de faire un knock-in
Désavantage de CRISPR cas-9?
off-target : on peut couper à plusieurs endroits dans le génome et non seulement dans le gène cible
Quels types de séquences sont ciblées par un criblage génétique? (2) Dites les avantages et désavantages de chacun.
- > Marqueurs microsatellites
- Avantage : Très polymorphique (change d’un individu à l’autre, mais on s’attend à ce que le nombre de répétitions microsatellites soit le mm pour les gens d’une mm famille (marqueur génétique))
- Désavantages : Couverture inégale, parfois des gap
- > Micropuce SNPs
- Avantage : Grande quantité de marqueurs (utilisation de fluorescent)
- Désavantage: Peu polymorphique (donne peu d’informations sur la différence entre qqun atteint vs qqun non atteint)
Types de criblage génétique selon ce qu’on prend comme échantillon (4).
- analyse de liaison
- études d’association
- séquençage de l’exome
- séquençage du génome
Analyse de liaison?
- > permet de cibler un chromosome ou une zone où peut se trouver le gène d’intérêt
- Nécessite des grandes familles
- Pour les maladies Mendéliennes
Étude d’association?
- Nécessite beaucoup d’individu
- Pour les maladies ou traits complexes
- > est-ce qu’il y a des SNP/marqueur qui se trouvent plus souvent dans le groupe expérimental vs le groupe contrôle? Étude de liaison du SNP avec un phénotype (mais attention, ce n’est pas du cause à effet, c’est une association)
Séquençage de l’exome?
- exome = tous les exons
- Permet d’identifier les variants
- Avantages : Identifie directement les variants potentiels, ne nécessite pas de grande familles
- Désavantages: Couvre 2% du génome, donc plus dispendieux
- > on prend l’ADN qu’on coupe au complet, on hybride avec quelque chose pour ne garder que les exons, puis on lave pour ne garder que les exons (mais d’autres choses restent aussi)
- reconstruction du génome en alignant les exons avec une séquence de référence, puis on regarde si on a des différences entre les 2
Séquençage du génome?
- Permet d’identifier les variants et CNVs
- Avantages: Identifie directement les variants potentiels, nécessite pas de grande familles, couvre le génome en entier (ou presque …)
- Désavantages : Dispendieux, limitation dans l’interprétation des données
De quoi est souvent suivi un criblage classique chez l’humain?
suivit d’un criblage inversé dans un modèle animal afin de valider l’association génotype phénotype
