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NSC2003 - Méthodes expérimentales en neurosciences > Cours 8 - Cultures cellulaires > Flashcards

Cours 8 - Cultures cellulaires Flashcards

1
Q

3 catégories de stratégie pour introduire de l’ADN dans une cellule

A
  • force physique
  • produits chimiques
  • vecteurs viraux
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Q

Facteurs qui déterminent la sélection de la stratégie pour introduire de l’ADN dans une cellule (3)

A

1- l’environnement cellulaire
2- type cellulaire
3-le but de l’expérience

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3
Q

Avantages (3) et désavantages (3) de la méthode physique pour introduire de l’ADN dans une cellule

A 
avantages :
- transfert de gènes très efficace 
- pas de limitation de taille
- pas dépendant du type cellulaire
désavantages :
- faible quantité de cellules peuvent être fait à la fois
- nécessite de l'équipement spécialisé
- peut abîmer physiquement les cellules
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4
Q

Avantages (6) et désavantages (5) de la méthode chimique pour introduire de l’ADN dans une cellule

A

avantages :
- très efficace in vitro (haut pourcentage de cellules transfectées)
- pas de limitation dans la taille
- très simple à utiliser
- rapide
- grande quantité de cellules peuvent être fait à la fois
- faible immunogénicité
désavantages :
- inefficace en in vivo
- pas efficace avec les neurones
- difficile d’obtenir des résultats consistants d’une fois à l’autre
- l’efficacité dépend du type de la cellule
- peut être toxique pour les cellules
- expression transitoire (peut durer quelques jours), donc pas bon pour observation à long terme

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Q

Avantages (4) et désavantages (6) de la méthode virale pour introduire de l’ADN dans une cellule

A

avantages :
- transfert de gènes très efficace et robuste
- il est possible de cibler spécifiquement un type cellulaire (« préférence » du virus, donc de cibler une zone spécifique)
- expression sur le long terme
- peut être utilisé in vitro et in vivo
désavantages :
- peut prendre plusieurs jours après l’injection pour que le gène s’exprime (pas expression immédiate)
- nécessite une méthode de clonage complexe
- plus dispendieuse que les autres méthodes
- peut être dangereux au niveau de l’infection du virus chez l’humain (biosécurité)
- peut provoquer une réponse immunitaire là où on injecte
- préparations laborieuses (et choix complexe du type de vecteur selon plusieurs critères)
- taille du vecteur viral limite la taille de l’ADN qui peut y être inséré (on ne peut pas insérer de longs gènes/séquences)

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6
Q

3 méthodes pour introduire l’ADN par une méthode physique

A

1- microinjection
2- électroporation
3- biolistique

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7
Q

Équipement requis pour faire une micro injection d’ADN dans une cellule. (3)

A
  • microscope
  • micromanipulateur (pour placer l’aiguille précisément)
  • pipette + grosse pour tenir la cellule en place
  • aiguille de VERRE (tenu par une pipette)
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8
Q

V ou F. Dans une micro injection, l’aiguille est en métal et d’une grosseur modérée.

A

F, elle est en verre et elle est très petite pour ne pas endommager la membrane cellulaire

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9
Q

V ou F. Dans une micro injection, la cellule incorpore l’ADN dans son génome. Est-ce qu’il sera dans un état stable ou instable?

A

V, donc dans un état stable

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10
Q

Avantages de la méthode de micro injection (1)

A
  • ADN incorporé de façon stable dans le génome
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11
Q

Désavantages de la méthode de micro injection (4)

A
  • une seule cellule injectée à la fois
  • demande beaucoup de dextérité manuelle
  • ADN est incorporé de manière aléatoire dans le génome
  • rarement utilisé pour introduire de l’ADN dans des neurones à cause de leur petite taille et fragilité
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12
Q

Dans quels cas on utilise la méthode de micro injection? (2)

A
  • pour produire souris transgénique (injection d’ADN dans l’oeuf fécondé de souris)
  • neurones de lamproie (car ils sont vraiment gros)
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13
Q

Mode fonctionnement de l’électroporation.

A

1 - on induit un champ électrique aux cellules, ce qui induit la formation de pores au niveau de la membrane cellulaire
2 - on met une anode (positif) d’un côté de la cellule, puis on met une cathode (négatif) de l’autre côté
3 - on met l’ADN qu’on veut introduire dans la solution dans laquelle baigne la cellule, puis l’ADN (chargé négativement) va être repoussé par la cathode et attiré par l’anode, donc il va migrer « à travers » la cellule
4 - on enlève le champ électrique, ce qui fait se fermer les pores de la cellule, et l’ADN qui a migré reste pris dedans

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14
Q

Avantages de la méthode d’électroporation (4)

A
  • peut être utilisé in vitro, in vivo et in utero (neurones dissociés, tranches de cerveau ou embryon)
  • peut transfecter plusieurs types cellulaires
  • possible de faire varier le niveau d’expression du gène en variant la force et le pattern du champs électrique
  • on peut contrôler dans quelle couche du cortex l’ADN va être incorporé en faisant varier la période
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15
Q

Étapes de l’électroporation in utero (5)

A

1- l’embryon est sorti de la mère (mais encore attaché à la mère)
2- l’ADN est injecté dans les ventricules de l’embryon
3- En utilisant des électrodes en forme de palette : l’ADN est introduit dans les cellules par un champs électrique qui dirige l’ADN chargé négativement vers l’anode
4- l’embryon est replacé dans la mère
5- Les neurones des embryons qui vont naître exprimeront le gène introduit par
électroporation

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16
Q

Cas particulier où il est utile d’utiliser l’électroporation.

A

pour introduire de l’ADN dans les neurones situés dans

des régions qui sont adjacentes aux ventricules (Ex: la moelle épinière du poulet et le cortex cérébral des rongeurs.)

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17
Q

Méthode de la biolistique? (1 phrase)

A

transfert d’un gène par particules en utilisant

un fusil à gène (gene gun)

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18
Q

Étapes pour introduire un gène par biolistique (7)

A

1 - Produire un mélange de particules de métaux lourds (tungsten ou or) et d’ADN
2 - Les particules de métaux lourds se lient à l’ADN qui est chargé négativement
3 - Les particules/ADN sont chargées sur une balle en plastique
4 - Un gaz pressurisé comme l’hélium est utilisé pour produire la force qui fait bouger la
balle
5 - La pression du gaz augmente jusqu’à ce qu’elle rupture le disque et ainsi la pression libérée va propulser la balle le long du conduit du fusil à gène
6 - La balle de plastique est retenue à l’intérieur du conduit par un filtre alors que les particules qui sont liées à l’ADN sont éjectées à travers le filtre.
7 - Les billes d’or pénètrent la membrane cellulaire et ainsi elles introduisent l’ADN dans
la cellule.

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19
Q

Avantages de la méthode biolistique (2)

A
  • Les cellules transfectées sont souvent dispersées, permet d’examiner la morphologie d’un neurone isolé (neurones au complet avec ses prolongements) suite à un traitement (observer effet d’une protéine)
  • peut permettre d’introduire de l’ADN dans une
    structure ayant une certaine épaisseur comme une tranche de cerveau
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20
Q

Désavantages de la méthode biolistique (2)

A
  • ne permet pas de transfecter des cellules in vivo (exception foie et cellules de la peau)
  • inconvénient majeur : peut causer des
    dommages importants aux cellules—optimisation requise
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21
Q

Différence entre transfection et transduction (quand on introduit un gène dans une cellule)

A
  • Transfection : méthode non virale
    pour introduire de l’ADN dans une cellule.
  • Transduction : l’ADN est introduit par un
    vecteur viral. Les virus s’attachent à la cellule pour injecter l’ADN, mais le vecteur viral ne peut pas se multiplier.
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22
Q

Méthodes d’introduction de l’ADN par une méthode chimique (2)

A
  • phosphate de calcium

- lipofection (avec complexes de lipides)

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23
Q

Fonctionnement de base de l’introduction de l’ADN par une méthode chimique

A
  • Utilisation d’un produit chimique pour faire rentrer l’ADN dans les cellules
  • L’ADN chargé négativement peut former un macro-complexe avec un produit chimique chargé positivement
  • Ces macro-complexes se fixent à la surface des cellules ce qui va promouvoir leur endocytose ou fusion avec la membrane
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24
Q

Avantages (4) et désavantage (2) de la transfection par phosphate de calcium.

A

avantages :

  • facile
  • fiable
  • pas dispendieuse
  • utile pour une expression transitoire
  • inconvénient majeur : son efficacité est faible pour transfecter des neurones (1-3%)
  • exclusivement utilisée en culture
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25
Q

Fonctionnement de la transfection par lipides (3)

A
  • utilisation des complexes de lipides pour introduire
    l’ADN dans les cellules
  • utilise des structures vésiculaires nommées liposomes qui ont la même composition que la membrane cellulaire (hydrophobe du côté cytoplasmique et hydrophile du côté extracellulaire)
  • Un liposome se forme autour de l’ADN, et il peut :
    1 - être endocyté selon le type de liposome et le type cellulaire
    2 - directement se fusionner avec la membrane cellulaire pour libérer l’ADN
    dans la cellule
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26
Q

Avantages (2) et désavantages (2) de la transfection par lipides

A

Avantages :
- fonctionne avec un très grand nombre de cellules incluant les neurones
- Des réactifs sont vendus par plusieurs compagnies—transfection se fait en moins de 30 minutes et l’expression de gène débute quelques heures après la transfection
désavantages :
- pas très efficace avec neurones (seulement 1-2 %)
- exclusivement utilisé en culture

27
Q

Fonctionnement de base de l’introduction d’un gène en utilisant un vecteur viral

A
  • Une région codante d’un virus est remplacée par le gène d’intérêt, et le virus est modifié en labo pour qu’il ne puisse plus se multiplier dans les cellules
  • le virus s’attache à une cellule dans le but d’y injecter son matériel génétique.
  • Ce matériel code pour des protéines nécessaires à la production du virus—les cellules infectées deviennent des usines à produire des virus.
28
Q

V ou F. Les vecteurs viraux sont un outil peu utilisé pour l’introduction de gènes dans le cerveau.

A

F, c’est l’outil de choix pour l’expression de gènes dans le cerveau d’animaux

29
Q

Technique de génétique utilisée pour construire un virus quand on introduit un gène en utilisant un vecteur viral?

A

recombinaison homologue

30
Q

Étapes pour construire un virus avec un gène d’intérêt dedans.

A

1 - on insère le gène d’intérêt dans un vecteur navette
2 - préparation du vecteur viral pour qu’il soit fonctionnel et infectieux, mais pour qu’il ne puisse plus se multiplier
3 - transfection entre le vecteur navette et le vecteur viral : le gène d’intérêt est incorporé par recombinaison homologue
-> la transfection se fait dans des cellules spéciales : HEK 293T
4 - 2 jours après la transfection, les cellules produisent plusieurs particules virales et les libèrent dans le milieu extracellulaire
5 - on prélève le milieu extracellulaire, on le met en éprouvette et on le centrifuge (parce que les cellules sont en suspension, donc on les sédimente)
6 - Le culot est resuspendu dans un tampon pour usage immédiat ou congelé pour usage ultérieur

31
Q

Pourquoi il y un type de cellule spécial utilisé pour la production de virus? Quelle est cette cellule?

A
  • cellule HEK 293T
  • prolifère rapidement
  • se transfecte facilement
  • peuvent produire une grande quantité de virus
32
Q

Étapes d’expression d’un gène d’intérêt par transduction (3)

A

1 - le virus s’adhère à la membrane plasmique, puis entre dans la cellule par endocytose
2 - dans la cellule, le virus est dans un endosome et son contenu va s’intégrer au noyau, où les gènes viraux vont être transcrits
3 - l’ARN viral sort du noyau, puis est traduit dans le cytosol

33
Q

Types de virus utilisés lors de l’introduction d’un gène en utilisant un vecteur viral (3)

A
  • adénovirus
  • virus adéno-associé (AAV)
  • lentivirus
34
Q

Dans les types de virus qui peuvent être utilisé (introduction d’un gène en utilisant un vecteur viral), lequel a la plus grande capacité (longueur de gène à introduire)? la moins grande capacité?

A
  • plus grand : adénovirus

- plus petit : adéno-associé (AAV)

35
Q

Avantages d’utiliser un adénovirus (3)

A
  • peut être utilisé avec des cellules post mitotiques ou mitotiques
  • grande efficacité de transduction
  • grande variabilité dans la capacité (de 7.5 à 30 kb)
36
Q

Désavantages d’utiliser un adénovirus (3)

A
  • expression transitoire (quelques semaines à quelques mois), ne s’intègre pas au génome (mais peut aussi être un avantage)
  • prend plusieurs jours avant que le gène ne s’exprime
  • peut causer une réponse inflammatoire et la mort cellulaire
37
Q

Avantages d’utiliser un virus adéno-associé (AAV) (5)

A
  • est naturellement déficient pour se multiplier, donc + sécuritaire
  • peut être utilisé avec des cellules post mitotiques ou mitotiques
  • expression stable/à long terme, intègre le génome
  • grande efficacité de transduction
  • moins toxique que l’adénovirus
38
Q

Désavantages d’utiliser un virus adéno-associé (AAV) (2)

A
  • prend plusieurs semaines avant que le gène ne s’exprime
  • production laborieuse et coûteuse
  • capacité limitée (seulement des gènes de 5 kb ou moins)
39
Q

Avantages d’utiliser un lentivirus (2)

A
  • peut être utilisé avec des cellules post mitotiques ou mitotiques
  • expression stable/constante, intègre le génome
40
Q

Désavantages d’utiliser un lentivirus (1)

A
  • problèmes de sécurité?
41
Q

Quelles choses sont nécessaires pour la production d’un AAV? (3)

A

1 - vecteur AAV
2 - ADN viral
3 - AAV helper

42
Q

Étapes d’intégration au noyau d’un AAV (6 étapes)

A

1 - virus s’attache à la membrane
2 - virus entre pas endocytose
3 - le virus s’échappe de la vésicule et s’accumule autour du noyau (périnucléaire)
4 - le virus entre dans le noyau, puis perd sa capsule
5 - le génome du AAV est simple brin, donc il est converti en double brin dans le noyau
6 - il peut finalement se passer 2 choses : soit il s’intègre de façon stable dans le génome, soit il reste en forme épisomale (pas intégré dans le génome)

43
Q

Qu’est-ce qui distingue le lentivirus des autres virus utilisés? (2)

A
  • appartient à la famille des rétrovirus

- possède un génome d’ARN plutôt que d’ADN

44
Q

Étapes d’intégration d’un lentivirus dans le génome d’une cellule (3)

A

1 - le lentivirus entre dans la cellule par endocytose
2 - l’ARN est libéré dans la cellule, et la transcriptase
inverse produit de l’ADNc, donc l’ADN complémentaire au génome du lentivirus
3 - L’ADNc migre au noyau où il est intégré dans le génome de l’hôte– expression à long-terme.

45
Q

Facteurs qui déterminent la méthode pour introduire un ADN dans une cellule (3)

A
  • type cellulaire
  • l’environnement cellulaire
  • le but de l’expérience
46
Q

Méthodes les plus utilisées en laboratoire pour introduire un ADN dans une cellule dans le cas de :

  • culture cellulaire
  • tranche de cerveau
  • in vivo (animal)
  • cellules individuelles
A
  • Culture cellulaire : transfection chimique, électroporation et virus
  • Tranches de cerveau : virus et biolistique
  • In vivo (animal) : virus et électroporation (principalement chez les embryons)
  • Cellules individuelles : microinjection, électroporation
47
Q

Pourquoi utiliser la culture cellulaire?

A

Étudier le rôle de gènes particuliers, de protéines ou de différents types cellulaires

48
Q

Co-culture?

A

deux types cellulaires qui sont cultivés ensemble (ex. une région du cerveau avec une autre—comment ils peuvent affecter le comportement de l’une de l’autre)

49
Q

Pourquoi il est plus pratique d’utiliser la culture cellulaire pour des manipulations pharmacologiques?

A

grande quantité, donc on peut tester beaucoup

50
Q

Avantages de la culture cellulaire (4)

A
  • Conditions d’expérimentation faciles à contrôler
  • Réduire les interactions avec d’autres organes qui pourraient exercer des effets sur les cellules d’intérêt.
  • Performer en parallèle plusieurs expériences avec un nombre exact de cellules: difficiles in vivo
  • Plus rapide, moins dispendieux et requiert un plus petit nombre d’animaux que les expériences in vivo
51
Q

Désavantages/limites de la culture cellulaire, les questions que ça soulève (3). Qu’est-ce qu’on doit en conclure?

A
  • cellule placée dans un pétri se comporte comme une cellule dans le cerveau ou dans un animal intact?
  • faire pousser un neurone isolé dans un pétri, mais dans le cerveau intact il est connecté à un réseau précis de neurones?
  • Est-ce que des lignées de cellules immortalisées (ex. neuroblastomes), des cellules qui ont la capacité de se diviser indéfiniment, sont un bon modèle pour les neurones qui sont des cellules post-mitotiques?
  • > conclusion : il faut interpréter et extrapoler les résultats in vitro avec prudence
52
Q

Types cellulaires utilisés en culture (3)

A
  • lignées de cellules immortalisées
  • Culture primaire
  • Cellules souches
53
Q

Composantes/équipements essentiels pour faire un milieu de culture cellulaire

A
  • le milieu doit alimenter les cellules en oxygène, en facteurs de croissance et autres éléments pour les maintenir en vie
  • réactifs pour prévenir les contaminations (parce que dans le corps, les cellules ont le système immunitaire, et dans le cerveau en plus il y a la barrière hémato-encéphalique), exemple hotte stérile
54
Q

Comment sont produites les lignées cellulaires immortalisées (de quelles cellules elles proviennent)?

A
  • Ces cellules ont été modifiées pour pouvoir se diviser indéfiniment — donc peuvent être gardées en culture sur une longue période de temps.
  • Ces cellules sont dérivées de différents types cellulaires qui ont des anomalies chromosomiques ou des mutations qui leur permettent de se diviser continuellement Ex. tumeurs (neuroblastomes)
55
Q

Quelle étape est importante pour pouvoir utiliser une culture en lignées cellulaires immortalisées (indice : les cellules se divisent continuellement)?

A
  • les cellules vont finir par recouvrir toute la surface du pétri, il faut donc les passer pour éviter une confluence de 100%
  • comment faire : détacher les cellules du plastique en utilisant de la trypsine (protéase qui clive les protéines membranaires d’adhésion), puis prendre une fraction des cellules et la transférer dans un autre pétri de culture
56
Q

Avantages des lignées cellulaires immortalisées (5)

A
  • Très bien caractérisées
    (utilisées par plusieurs laboratoires)
  • elles sont homogènes et constituent une population génétiquement identiques, donc résultats constants et reproductibles
  • Plus faciles à cultiver que les cellules primaires (qui sont prélevées d’un animal à chaque culture)
  • Étant donné qu’elles poussent rapidement et continuellement, il est possible d’extraire des quantités importantes de protéines pour des essais biochimiques
  • Possible de produire une lignée qui exprime de façon permanente une protéine fusionnée à un tag fluorescent, donc facilite la microscopie sur des cellules vivantes
57
Q

Désavantages des lignées cellulaires immortalisées (3)

A
  • elles ne sont pas considérées comme normales, elles se divisent continuellement et expriment un pattern de gènes qu’on ne retrouve pas dans des cellules in vivo (animal intact)
  • Elles n’ont peut-être pas les fonctions d’une cellule normale
  • Après une certaine période de prolifération continuelle, les caractéristiques des cellules sont modifiées, ne pas utiliser des cellules qui ont été passées trop de fois
58
Q

Lignée souvent utilisée pour les cellules immortalisées d’origine neurale. De quoi ces cellules ont besoin pour se différencier en neurone? Comment elles se différencient? Elles sont utilisées pour étudier quoi surtout?

A
  • PC12
  • elles ont besoin de NGF pour se différencier de façon réversible en neurones
  • en présence de NGF, elles vont produire des neurites, soit des prolongements qui ressemblent énormément à l’axone, mais pas de dendrite et elles vont exprimer des enzymes impliquées dans la synthèse de neurotransmetteurs
  • sont utilisées pour étudier surtout la différenciation neurale
59
Q

Quel type cellulaire (lignées cellulaires immortalisées) est surtout utilisée pour étudier la fonction de protéines spécifiques aux neurones?

A

neuro2A

60
Q

Compléter la phrase. La culture primaire et la culture de tissu utilisent des tissus prélevés…

A

directement d’un animal

61
Q

La culture primaire permet de faire quoi? (3)

A
  • isoler une population spécifique de cellules (ex. neurones ou cellules gliales) et d’examiner la fonction d’un type cellulaire spécifique
  • examiner différents aspects de la fonction des neurones (ex. les propriétés électrophysiologiques) et d’utiliser des agents pharmacologiques pour manipuler cette fonction
  • permet d’étudier au niveau moléculaire les effets de la modification génétique
62
Q

V ou F. L’extrapolation des résultats venant d’une culture primaire est plus pertinente que celle qui est faite à partir de lignées cellulaires. Pourquoi?

A

V. Les cultures primaires ont été isolées

du tissu animal.

63
Q

Désavantages de la culture primaire (2)

A
  • Survie limitée
  • L’âge de l’animal à laquelle les cellules sont prélevées influence la santé et la robustesse des cellules : plus l’animal est jeune, plus les cellules sont en santé et robustes.
64
Q

Types de culture primaire (3). Décrire brièvement (d’où vient le prélèvement)?

A
  • cultures de tranches de tissu : tranche au complet d’un tissu
  • explants : seulement une partie d’une tranche
  • cultures dissociées : on isole des cellules venant de l’explant

NSC2003 - Méthodes expérimentales en neurosciences (6 decks)

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