Cours 10 - Microscopie Flashcards
Microscope composé?
2 lentilles ou plus
Grossissement?
Il se réfère à combien l’échantillon apparaît plus grand par rapport à sa taille réelle ou combien de fois l’image a été grossie par le microscope (10X, 100X, 1000X).
Résolution?
- qualité/netteté de l’image
- définition : la plus petite distance entre 2 points d’intérêt pouvant être distinguée par un microscope
- permet de séparer 2 objets étroitement placés sur une image
V ou F. Plus le grossissement est fort, plus la résolution est bonne.
F, pas nécessairement
Formule de la résolution
r = 1.22 * (λ / 2* ON)
Que veut dire ON?
ouverture numérique
Relation entre la résolution et les variables dans la formule.
- r est directement proportionnel à la longueur d’onde (λ)
- r est indirectement proportionnel à l’ouverture numérique (ON)
V ou F. Plus la valeur de r est petite, meilleure la résolution est. Expliquer.
V, r = la plus petite distance entre 2 points, donc a une meilleure résolution si la distance entre 2 points est très petite
Quoi faire pour améliorer résolution (r)? (2)
- diminuer longueur d’onde
- augmenter l’ouverture numérique
Spectre visible?
spectre électromagnétique visible par l’oeil humain
V ou F. Plus la longueur d’onde est courte, plus l’énergie est basse.
F, Plus la longueur d’onde est courte, plus l’énergie est élevée
La lumière avec une longueur d’onde de 400 nm et moins porte quel nom?
ultraviolet
La lumière avec une longueur d’onde de 700 nm et moins porte quel nom?
infra-rouge
Définition de l’ouverture numérique (ON).
c’est une mesure de la capacité de collecter la lumière
V ou F. Il faut une ON faible pour avoir une meilleure résolution.
F, plus la ON est élevée, meilleure est la résolution
L’ON dépend de…? (2)
- l’indice de réfraction du milieu dans lequel l’objectif se trouve (ex. eau, huile, air)
- l’angle avec lequel la lumière pénètre l’objectif du microscope
Formule pour calculer ON. Dites à quoi correspond les variables.
ON = n * sin (𝛼)
- n : indice de réfraction
- 𝛼 : angle
Comment on peut moduler l’indice de réfraction pour l’ON?
en changeant le milieu (eau, air, huile), et on utilise un objectif différent selon le milieu
Quel objectif a une meilleure résolution, une pointe « fine » ou une pointe » large »?
la pointe large, car permet de faire entrer plus de lumière, donc fait entrer plus de photons, donc + d’informations sont captées
Par quoi est limité la microscopie optique?
seulement avec le spectre optique (lumière visible), et la longueur d’onde la plus basse de spectre optique est de 400 nm, ce qui permet d’avoir une résolution de 0.2 micromètre, ce qui n’est pas très bon
Microscope simple?
- Réfraction de la lumière dans un plan focal
- Magnification limitée
- une seule lentille
Lentilles d’un microscope composé
- deux ou plus, mais généralement il y a :
1 - lentille de l’objectif (proche a l’échantillon)
2 -lentille oculaire (proche d l’oeil)
Les composants les plus importants d’un microscope composé (3)
1 - La lentille de l’objectif (objective lens) est placée près de l’échantillon. La magnification peut être choisie dépendant de l’objectif (4X, 10X, 20X, 40X, 60X or 100X)
2 - Le condenseur (condenser) focalise la lumière de la source sur l’échantillon
3 - La lentille oculaire (ocularlens) ramasse la lumière de l’échantillon et magnifie l’image (la plus fréquente magnification: 10X)
Compléter la phrase. Un microscope optique est tout microscope qui utilise la __ __ pour illuminer et créer une image de l’échantillon
lumière visible
Microscopie en champ clair?
- L’illumination se fait par transmission de lumière blanche
- La lumière traverse directement ou est réfléchie par l’échantillon
Avantages (3) et désavantages (3) de la microscopie en champ clair
- > Avantages :
- Simple et pas chère
- Marqueurs de couleur peuvent être utilisé
- Utilisation : échantillons fixés.
- > Désavantages :
- La plupart des cellules sont transparentes, donc nécessité de marquage (teinture, toxicité potentiel)
- Faible contraste
- Résolution faible
Microscopie à contraste de phase?
Technique qui met en valeur les différences d’indices de réfraction et de contraste
Avantages (3) et désavantages (1) de la microscopie à contraste de phase
- > Avantages :
- Peut être utilisée pour visualiser les cellules vivantes
- Pas besoin d’utiliser des produits chimiques ou préparation du tissue (pas besoin de fixer)
- Utilisation : cellules en culture.
- > Désavantages :
- Beaucoup de signaux hors focus.
Microscopie en champ sombre?
- Permet d’améliorer le contraste d’échantillons transparents mais non teintés
- Le contraste provient de la lumière diffusée par l’échantillon
Avantages (3) et désavantages (1) de la microscopie en champ sombre
- > Avantages :
- Peut être utilisée pour visualiser les cellules vivantes
- Bon rapport signal/bruit
- Utilisation : échantillons pour hybridation in situ (sondes radioactives).
- > Désavantages :
- Limitée aux échantillons qui dispersent bien la lumière.
Microscope à contraste interférentiel (Nomarski)?
Utilise des modifications optiques pour exagérer les changements dans les propriétés de diffusion de lumière « scattering » des structures cellulaires
-> penser au tardigrade
Avantages (4) et désavantages (1) de la microscopie à contraste interférentiel (Nomarski)
- > Avantages :
- Peut être utilisée dans des cellules vivantes
- Bon rapport signal/bruit
- surligne les bords et les ombres de l’échantillon pour créer une apparence en 3D
- Utilisation : cellules en culture et tissus.
- > Désavantages :
- Limitée a l’imagerie d’un seul plan focal (mince) à la fois.
Types de microscopie à fluorescence (4)
- Microscopie à fluorescence standard
(epifluorescence) - Microscopie à fluorescence confocale
- Microscopie à deux-photons (multiphotonique)
- Microscopie STED (déplétion par émission
stimulée)
Quel type de microscopie est le plus utilisé en neurosciences?
microscopie à fluorescence
Composantes spéciales pour une microscopie à fluorescence (3)
- microscope optique composé, mais qui est aussi équipé d’un émetteur à laser qui permet la sélection d’une longueur d’onde précise
- l’échantillon est illuminé par une source de haute énergie (laser)
- fluorophore dans l’échantillon : substance chimique pouvant émettre de la fluorescence après excitation par la lumière
V ou F. La longueur d’onde émise par un fluorophore après qu’il soit excité est la même avec laquelle il a été excité.
F. La longueur d’onde émise est un peu plus basse que celle avec laquelle il a été excité, car il y a une perte d’énergie
Quel est « l’état énergétique » du fluorophore qu’on détecte avec le microscope?
1 - quand le fluorophore est excité, son énergie augmente
2 - son énergie redescend rapidement, et la longueur d’onde captée par le microscope est celle qui se trouve juste en haut de celle qui sera émise (graphique diapo 52)
–> IMPORTANT
V ou F. Le microscope optique à fluorescence n’a besoin de connaître qu’une seule longueur d’onde.
F. Il doit en connaître 2 :
- une fréquence pour exciter le fluorophore
- capable de visualiser à une autre longueur d’onde
Quand on met les valeurs de longueur d’onde d’excitation et d’émission sur une courbe, est-ce que les 2 courbes se chevauchent? Pourquoi?
elles sont décalées : celle d’émission est + vers la droite, parce que la longueur d’onde d’excitation est plus élevée que celle d’émission (perte d’énergie)
Si on veut utiliser plusieurs fluorophores dans un échantillon (pour identifier plusieurs choses), qu’est-ce qu’on doit prendre en compte?
on doit faire attention de prendre des fluorophores avec des longueurs d’ondes très éloignées
V ou F. Dans un microscope à fluorescence standard, la longueur émise par le laser est directement celle qu’on veut.
F. Elle passe par un filtre d’excitation qui permet le passage de lumière dans un rang spécifique de longueurs d’ondes (dépend du filtre), donc ne laisse passer que la longueur d’onde désirée
Avantages pour toutes les formes de microscopie à fluorescence (4) et une spécifique pour la microscopie à fluorescence standard. IMPORTANT
- Peut être utilisée pour détecter de molécules marquée a la fluorescence
- Plusieurs fluorophores peuvent être utilisés au même temps
- Très bon rapport signal/bruit
- Très sensible, permet la détection de molécules en faible quantité
- Fluorescence standard seulement : l’acquisition des images est relativement simple (par rapport d’autres méthodes de microscopie à fluorescence).
Limitations de la microscopie à fluorescence standard. (3) IMPORTANT
- la lumière émise par le fluorophore diminue avec le temps (photoblanchiment)
- pendant l’illumination de cellules vivantes, la lumière peut causer de la mort cellulaire (phototoxicité)
- le bruit de fond peut être élevé à cause de la fluorescence non spécifique et l’autofluorescence du tissu
Problème de la microscopie à la fluorescence standard avec les échantillons épais.
- > avec cette méthode, l’objet doit absolument être dans le plan focal du système optique pour que l’image optique, mais :
- la lumière émise par le plan focal, donc nette, est perdue dans la fluorescence émise par les plans adjacents au plan focal, qui par définition sont flous (car l’objet est épais)
Microscopie confocale? Quels types d’image on obtient? (2)
- utilise une illumination focalisée sur un point dans une profondeur spécifique (plan focal) à différents niveaux de profondeur
- sections optique : images de très faibles profondeur de champ
- z-stack : séries d’images à partir desquelles ont obtient une représentation en 3D de l’objet, l’objet n’est donc pas directement observé, on voit plutôt une image recomposée par ordi -> on peut aussi choisir une seule image dans le plan Z (plan « profondeur »)
Par rapport à la microscopie à la fluorescence standard, pourquoi la résolution est augmentée dans la microscopie confocale?
parce qu’on élimine le bruit autour
Avantages de la microscopie confocale (3).
- Permet l’acquisition des images extrêmement nettes
- Seules les images dans le plan focal sont ramassées
- Permet l’imagerie des échantillons plus épais.
Limitations de la microscopie confocale (2).
- requière une illumination à long terme (illuminer tous les plans z), donc augmente le phénomène de photoblanchissement
- la pris d’images est lente, donc ça rend difficile la visualisation d’événements rapides
- > pourtant, c’est une technique beaucoup utilisée en neurosciences
diapo
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