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Biochimie - Laboratoire BCM-1902 > Cours 8 - PCR > Flashcards

Cours 8 - PCR Flashcards

1
Q

Qu’est-ce que le rôle de la PCR

A

La PCR permet de choisir un segment d’ADN particulier dans un génome et d’amplifier cette séquence cible de manière exponentielle afin d’en obtenir des millions de copies.

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Q

RAPPEL:
Que permet la complémentarité des bases?

A
  • Dénaturation/renaturation
  • Hybridation/appariement
  • Élongation de l’amorce par
    une ADN polymérase
    (5’–>3’)
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3
Q

Quelle enzyme permet le succès fulgurant de la PCR?

A

L’ADN polymérase Taq

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4
Q

Quelle est la taille générale des fragments d’ADN générés par la polymérase Taq?

A

Généralement taille ≤ 4000 pb

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5
Q

Quelle est la principale caractéristique de la polymérase Taq qui permet une PCR efficace?

A

C’est une enzyme résistante aux températures élevées (95°C)
Température optimale: 72°C

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6
Q

VRAI OU FAUX
La séquence cible augmente de manière exponentielle?

A

VRAI
La nombre de copies de la séquence cible double à chaque cycle.

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7
Q

Quelle est l’équation permettant de prédire le nombre total de copies de la séquence cible?

A

Y = x2^n
Y : nb final de copies
x : nb initial de copies
n : nb de cycles

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8
Q

Comment se nomme l’appareil qui permet de chauffer et refroidir les échantillons durant des temps précis lors d’une réaction d’amplification PCR ?

A

Thermocycleur

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9
Q

VRAI OU FAUX
Les températures suivantes sont en ordre chronologique normal d’une réaction PCR:
95°C –> 72°C –> 55°C

A

FAUX
1. 95°C pendant 30 à 60s
2. 40-65°C pendant 30 à 60s
3. 72°C pendant 30 à 60s

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10
Q

Nommez les 3 étapes d’une réaction PCR

A
  1. Dénaturation
  2. Hybridation
  3. Élongation
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11
Q

Quel est le nom de chacun des brins du fragment d’ADN à amplifier? Comment les différencie-t-on?

A

Brin Watson: 5’ –> 3’
Brin Crick: 3’ –> 5’

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12
Q

En quoi consiste la première étape d’une réaction PCR?

A

Dénaturation: bris des ponts H grâce à la chaleur (95°C)

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13
Q

En quoi consiste la seconde étape d’une réaction PCR?

A

Hybridation: fixation d’un couple d’amorces à 40-65°C.
La 1ère amorce s’apparie au brin Watson
La 2e amorce s’apparie au brin Crick

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14
Q

En quoi consiste la troisième étape d’une réaction PCR?

A

Élongation: Attaque polymérase à 72°C

C’est donc la synthèse d’un brin complémentaire par la Taq polymérase

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15
Q

Qu’est-ce que la Tm?

A

Température de fusion: température à laquelle 50% des molécules d’amorce sont associées à la matrice

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16
Q

Quel(s) facteur(s) influence(nt) la Tm d’une amorce?

A
  • La longueur de l’amorce
  • Le % G+C de l’amorce
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17
Q

Comment calcule-t-on la valeur approximative de la Tm d’une amorce?

A

On attribue 2°C pour chaque A et T
On attribue 4°C pour chaque G et C
Ainsi:
Tm = 4( nb de G + nb de C) + 2( nb de A + nb de T)

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18
Q

Comment calcule-t-on la température d’appariement?

A

Tm - 5°C

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19
Q

VRAI OU FAUX
La durée de l’élongation dépend de la longueur de l’amorce.

A

FAUX
Elle dépend de la longueur de la SÉQUENCE CIBLE
–> 1kb/min

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20
Q

VRAI OU FAUX
Il n’y a aucune limite de cycles lors d’une réaction PCR.

A

FAUX
Nombre total de cycles ≤ 30

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21
Q

Expliquez le phénomène de plafonnement lors de l’élongation.

A

À partir de 20 à 25 cycles, l’enzyme est de moins en moins efficace.
La réaction atteint donc un plateau.

22
Q

Que se passe-t-il de particulier à la fin du dernier cycle lors de l’élongation? Pourquoi est-ce important?

A

Une étape d’élongation additionnelle est effectuée.
Cela a pour but de s’assurer que la synthèse de tous les brins est complète.

23
Q

Quelle est la taille du génome humain?

A

3,4 x10^9 pb

24
Q

Qu’est-ce qui détermine le spécificité de la PCR?

A

Les amorces
Il y a une amplification spécifique de la séquence comprise entre les extrémités 5’ des deux amorces.

25
Q

Quelles sont les 2 amorces?

A

Forward
- Représente le brin Watson
(5’–> 3’)
- Se retrouve au début de la séquence du plasmide
Reverse
- Représente le brin Crick
(3’–> 5’)
- Se retrouve à la fin de la séquence du plasmide

26
Q

Pourquoi est-ce que la longueur des amorces est un facteur critique?

A

Plus l’amorce est longue, plus l’hybridation est spécifique.

S’il manque de spécificité, il y aura plus de points d’encrage et cela est à éviter.

27
Q

Quelle est la longueur moyenne des amorces?

A

15 à 35 nucléotides

28
Q

VRAI OU FAUX
Pour le génome humain, il faut utiliser des amorces de moins de 17 bases.

A

FAUX
D’au moins 17 bases

29
Q

Comment calcule-t-on le nombre de séquences possibles pour un oligonucléotide?

A

4^n
où n : nb de bases

30
Q

(Cette question me mélange, SOPHIA Quelle(s) caractéristique(s) doit/doivent être retrouvée(s) chez une amorce parmi les suivantes?

a) Les amorces doivent absolument débuter par
un G
b) L’extrémité 3’ de chaque amorce doit
s’apparier parfaitement au gabarit
c) Les amorces ont un Tm différent
d) Les amorces n’ont pas la capacité de former des structures secondaires.
e) Les amorces sont complémentaires

A

a) Ne doit pas être retrouvée
b) Doit pas être retrouvée
c) Ne doit pas être trouvée
–> Doivent avoir un Tm semblable (moins de
5°C de différence)
d) Doit être retrouvée
e) Ne doit pas être retrouvée

31
Q

Quelle est la conséquence de la présence de séquences complémentaires à l’intérieur d’une même amorce?

A

Cela empêche l’appariement avec la séquence cible.
Il y aura formation d’une structure secondaire appelée “épingle à cheveux”.

32
Q

Quelle est la cause d’une élimination des amorces lors du refroidissement?

A

Une complémentarité de bases entre les deux amorces. Ceci est une caractéristique à éviter lors du choix d’amorces.

33
Q

Nommez quelques applications de la PCR

A
  • Domaine médical et divers domaines de la microbiologie: détection d’organismes pathogènes ou de virus
  • Analyse de l’expression de gènes spécifiques: suivre le développement du cancer et évaluer les effets d’un traitement
  • Médecine légale: identification d’individus par l’analyse de polymorphismes
34
Q

Qu’est-ce que des polymorphismes génétiques?

A

Les variations de séquence parmi les individus d’une population.
En moyenne, il y a une variation tous les 1000 nucléotides.

35
Q

Qu’est-ce que le génotype?

A

La séquence du génome d’un individu.
C’est donc l’ensemble des gènes qui concertent le développement d’un attribut observé chez un système biologique.

36
Q

VRAI OU FAUX
Le génotype d’un individu à celui d’un autre de la même espèce est similaire.
Pour l’humain, il y a une similarité de 89,9%

A

FAUX
Similarité de 99,9%

37
Q

Qu’est-ce qu’un allèle

A

Chaque variant d’un gène à un locus donné.

38
Q

De quelle façon sont hérités les allèles?

A

De façon Mendélienne

39
Q

Qu’est-ce que le phénotype?

A

Un attribut/trait observable chez un système biologique.
Lorsque le phénotype est modifié, il y aura un changement visible dans l’apparence.

40
Q

Que sont les variations ponctuelles?
a) Un type de polymorphismes où une séquence de 1000 nucléotides est modifiée par une autre.
b) Un type de polymorphismes où il y a une modification de séquence chez chacun des individus dans une population observée.
c) Un type de polymorphismes où un nucléotide est remplacé par un autre.

A

c) Un type de polymorphismes où un nucléotide est rempalcé par un autre.
Les variations ponctuelles sont appelées SNP, ce qui veut dire Single Nucleotide Polymorphism.

41
Q

Quels sont les 2 types de polymorphismes de répétitions?

A
  • STR : short tandem repeat
    –> microsatellites
  • VNTR: variable number of tandem repeats
    –> minisatellites
42
Q

En quoi la capacité aux STR et VNTR d’être analysés par PCR est utile?

A

Les STR et VNTR peuvent servir à l’identification d’individus.

43
Q

Quelles caractéristiques parmi les suivantes peuvent être associées aux polymorphismes de répétitions STR et VNTR?
Longueur du motif:
a) 2 à 6 nucléotides
b) 9 à 15 nucléotides
c) 16 à 25 nucléotides
d) 30 nucléotides et plus
Nombre de répétitions:
e) 5
f) 5 à 25
g) 5 à 25
h) 5 à 50
i) 10 à 100
j) 10 à 250
k) 10 à 500
l) 10 à 750
m) 10 à 1000
Nombre de sites par génome:
n) Moins de 10
o) Quelques dizaines
p) Quelques centaines
q) 5000
r) 5 x 10^4
s) 5 x 10^5
t) 5 x 10^6

A

STR
Longueur motif: a) 2 à 6 nucléotides
Nombre de répétitions: h) 5 à 50
Nombre de sites par génome: s) 5 x 10^5

VNTR
Longueur motif: c) 16 à 25 nucléotides
Nombre de répétitions: k) 10 à 500
Nombre de sites par génome: p) Quelques centaines

44
Q

Sur quel chromosome est le locus du VNTR pMCT118?

A

Sur le chromosome 1

45
Q

VRAI OU FAUX
le pMCT118 a un motif répété de 26 nucléotides?

A

FAUX
Motif répété de 16 nucléotides

46
Q

Dans quelle région retrouve-t-on pMCTT118?

A

Dans une région non codante.

47
Q

VRAI OU FAUX
pMCTT118 est associé à quelques maladies et prédisposition. Il est donc phénotypiquement non neutre.

A

FAUX
pMCTT118 n’est associé à aucune maladie ni à une prédisposition. Il est donc phénotypiquement neutre.

48
Q

Combien de copies du motif de pMCTT118 sont contenues par les allèles?

A

14 à 41 copies

49
Q

Combien d’allèles sont connus pour pMCTT118?

A

28 allèles connus

50
Q

Lors de l’analyse PCR sur gel, comment peut-on déterminer si une personne est homogyzote ou hétérozygote?

A

Sur le gel, une personne homozygote n’aura qu’une seule bande puisque les allèles seront identiques.

Une personne hétérozygote aura 2 bandes puisqu’elles possèdes 2 allèles distincts.

51
Q

Lors de l’analyse PCR sur gel, comment peut-on déterminer qui a le plus grand nombre de répétitions dans son génome parmi plusieurs individus?

A

Plus il y a de répétitions, plus la taille de l’allèle est importante.

Ainsi, la personne ayant les bandes les plus élevées sur le gel sera la personnes ayant le plus grand nombre de répétitions.

52
Q

Lors de l’analyse PCR sur gel, comment peut-on déterminer un parent et son enfant?

A

L’enfant aura 1 des gènes de son parent. Ainsi, on cherche deux individus ayant 1 bande en commun sur le gel.

Biochimie - Laboratoire BCM-1902 (4 decks)

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