Cours 11 - Électrophorèse de protéines

Question 1

Qu’est-ce que l’électrophorèse?

Answer 1

Principe pour une séparation en fonction de la masse moléculaire des protéines à l’aide d’un gel poreux

Question 2

Que représentent des conditions dénaturantes?

Answer 2

Conditions auxquelles les molécules ne sont pas sous leur conformation native et sont dénaturées par un détergent

Question 3

Quelle est la différence entre un gel de concentration et un gel de séparation?

Question 4

Que veut dire SDS-PAGE?

Answer 4

Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis

Question 5

Décrivez le gel polyacrylamide

Answer 5

• Mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide.
• Utilisation : pour les acides nucléiques de petites
  tailles, et les protéines.
• Gel non chargé et inerte.
• Conditions dénaturantes ou non dénaturantes.

Question 6

Que se produit-il lorsque le gel acrylamide est polymérisé avec un agent réticulant?

Answer 6

Il y a formation d’un gel poreux, en raison des longues chaines linéaires formées non liées entre elles.

Question 7

De quoi dépend la taille des pores?

Answer 7

Du % total d’acrylamide et de bis-acrylamide ainsi que de la proportion acrylamide/bis-acrylamide

Question 8

Le % d’acrylamide est égale à 7,5% et sa gamme de séparation est entre 45 et 400 kDa, quelle sera la nouvelle gamme de séparation si on augmente le % d’acrylamide? (donner un approximatif)

Answer 8

Plus le % augmente plus la gamme de séparation sera petite

Question 9

Quelle est la fonction du persulfate d’ammonium?

Answer 9

Sert d’initiateur de la réaction puisqu’il fournit les radicaux libres nécessaires pour la polymérisation

Question 10

Quelle est la fonction du TMED?

Answer 10

Il est rajouté au mélange afin d’accélérer la
réaction de polymérisation

Question 11

Nommez les 3 principaux types d’électrophorèse

Answer 11

1. Électrophorèse en conditions non dénaturantes =
   conditions natives
2. Électrophorèse en conditions dénaturantes
3. Électrophorèse à deux dimensions (2D) :
   * Électrophorèse par isofocalisation (1ère
   dimension)
   * SDS-PAGE deuxième dimension

Question 12

Expliquez brièvement les principes d’électrophorèse en conditions natives

Answer 12

• La séparation dépend de la charge nette, de la
  structure et de la taille des protéines;
• Ce type de séparation est utilisée lorsque la
  structure de la protéine doit être conservée;

Question 13

Pour quelles études sont utilisés les électrophorèses non dénaturantes?

Answer 13

• Études structurales et fonctionnelles: par exemple,
  détection de l’interaction protéine-protéine
  (complexe protéique);
• Études enzymatiques: L’activité enzymatique peut
  souvent être démontrée après l’électrophorèse.

Question 14

Expliquez brièvement les principes d’électrophorèse en conditions dénaturantes

Answer 14

Uniformisation de la forme et de la densité de charge avec un détergent anionique (SDS: Sodium Dodécyl-Sulfate). La séparation se fait donc selon la masse moléculaire uniquement.

Question 15

Que permet l’électrophorèse en conditions dénaturantes?

Answer 15

• La détermination de la masse moléculaire apparente des protéines
• De déterminer le nombre de sous-unités d’une protéine
• De déterminer la pureté d’un échantillon

Question 16

En quoi la dégradation est différente de la dénaturation?

Answer 16

DÉGRADATION:
- IRRÉVERSIBLE
- Les protéases causent la perte de la structure primaire
- La protéine est dégradée

DÉNATURATION:
- Réversible
- Le changement de température ou de pH cause la perte des structures tertiaire et quaternaire
- La protéine est dénaturée

Question 17

Nommez les agents dénaturants pour les protéines

Answer 17

• Chaleur, pH : déplie et linéarise les molécules
• Sodium Dodécyl-Sulfate: recouvre les molécules de
  charges négatives
• β-mercaptoéthanol + chaleur : rupture des ponts
  disulfures formé entre les résidus Cys

Question 18

Quelles sont les deux principales différences entre un système continue et discontinue?

Answer 18

Système continu : Un seul gel de polyacrylamide et un seul système de tampon.
Système discontinue: Superposition de deux gels de polyacrylamide et deux tampons de pH différent

Question 19

Que permet l’ajout de deux tampons à pH différent dans un système discontinu?

Answer 19

Permet de concentrer les échantillons en une fine
bande, pour une meilleure résolution.

Question 20

Quelles sont les deux gels retrouvés dans le système discontinu?

Answer 20

Gel de concentration / d’empilement (2-4%)
Gel de résolution / de séparation (7-15%)

Question 21

À quoi sert l’utilisation de ces deux gels (empilement et séparation)?

Answer 21

Le gel d’empilement permet aux protéines
d’arriver en même temps au niveau du gel de
séparation. (En raison du pH du tampon, leur migration sera différente en raison de leur PI respectif)

Question 22

Expliquer ce que l’on va observer comme processus avec les protéines en l’absence le gel d’empilement. Expliquez le processus du gel de séparation également

Answer 22

Gel d’empilement: En absence du gel d’empilement, les protéines n’entreraient pas en même temps dans le « gel de séparation » et formeraient des bandes larges et diffuses
Gel de séparation: Les protéines poursuivent leur migration vers l’anode mais le % d’acrylamide du gel étant plus élevé cette fois par rapport au gel d’empilement, elles se séparent selon leurs tailles (les petites protéines migrent plus vite).

Question 23

Comment se fait la détermination de la taille d’une protéine à partir du gel d’électrophorèse ?

Answer 23

À l’aide de la courbe de standard du marqueur Broad Range

Question 24

a) À partir de l’image ci-contre, dans quels puits se retrouvent les protéines IgG traitées au β-mercaptoéthanol ?

b) Que représentent les deux points de coupures dans les puits 2,3,4 ?

Answer 24

a) Puits 2,3,4
b) Le β-mercaptoéthanol a coupé deux protéines, une provenant d’une chaine lourde (la plus haute) et la chaine plus légère (la plus basse)

Question 25

Vrai ou Faux
Tris-Tricine-SDS-PAGE est un autre type de SDS-PAGE. La tricine est souvent utilisée comme tampon en électrophorèse. Cette molécule est moins polarisée (plus négative) que la glycine et donc migre moins rapidement.

Answer 25

Faux, PLUS polarisée que la glycine donc migre plus rapidement.

Question 26

La Tris-Tricine-SDS-PAGE est utilisée surtout pour quelle gamme de taille des protéines?

Answer 26

Inférieure à 30 kDa

Question 27

La modification post-traductionnelle peut-elle affecter le poids moléculaire apparent sur SDS-PAGE? Si oui, quelles en sont les effets ?

Answer 27

Oui, les protéines peuvent donc se lier moins avec le SDS-PAGE

Question 28

Nommez deux types de modifications post-traductionnelles

Answer 28

Phosphorylation et glycosylation

Question 29

Pour l’électrophorèse à 2 dimensions, quelle est l’utilité de commencer une électrophorèse par isofocalisation comme 1er dimension? Et le SDS-PAGE comme 2e dimension?

Answer 29

Chaque protéine arrête de migrer
lorsque pH = pI. On connaît alors le pI de la protéine. La 2e dimension sert à déterminer à l’aide du SDS-PAGE la masse des protéines. Ainsi, cette méthode à deux dimensions permet de déterminer le PI et la masse moléculaire de la protéine.

Question 30

Qu’est-ce qui est utilisé pour permettre l’isofocalisation des protéines ?

Answer 30

Un gel qui contient une série
d’ampholytes pour créer le gradient de pH

Question 31

Quel réactif peut inhiber la réaction de polymérisation d’un gel de polyacrylamide ?

Answer 31

L’oxygène (l’air)