Cours 11 - Électrophorèse de protéines Flashcards
Qu’est-ce que l’électrophorèse?
Principe pour une séparation en fonction de la masse moléculaire des protéines à l’aide d’un gel poreux
Que représentent des conditions dénaturantes?
Conditions auxquelles les molécules ne sont pas sous leur conformation native et sont dénaturées par un détergent
Quelle est la différence entre un gel de concentration et un gel de séparation?
Que veut dire SDS-PAGE?
Sodium Dodecyl-Sulfate Polyacrylamid Gel Electrophoresis
Décrivez le gel polyacrylamide
- Mélange d’acrylamide et de bis-acrylamide.
- Utilisation : pour les acides nucléiques de petites
tailles, et les protéines. - Gel non chargé et inerte.
- Conditions dénaturantes ou non dénaturantes.
Que se produit-il lorsque le gel acrylamide est polymérisé avec un agent réticulant?
Il y a formation d’un gel poreux, en raison des longues chaines linéaires formées non liées entre elles.
De quoi dépend la taille des pores?
Du % total d’acrylamide et de bis-acrylamide ainsi que de la proportion acrylamide/bis-acrylamide
Le % d’acrylamide est égale à 7,5% et sa gamme de séparation est entre 45 et 400 kDa, quelle sera la nouvelle gamme de séparation si on augmente le % d’acrylamide? (donner un approximatif)
Plus le % augmente plus la gamme de séparation sera petite
Quelle est la fonction du persulfate d’ammonium?
Sert d’initiateur de la réaction puisqu’il fournit les radicaux libres nécessaires pour la polymérisation
Quelle est la fonction du TMED?
Il est rajouté au mélange afin d’accélérer la
réaction de polymérisation
Nommez les 3 principaux types d’électrophorèse
- Électrophorèse en conditions non dénaturantes =
conditions natives - Électrophorèse en conditions dénaturantes
- Électrophorèse à deux dimensions (2D) :
* Électrophorèse par isofocalisation (1ère
dimension)
* SDS-PAGE deuxième dimension
Expliquez brièvement les principes d’électrophorèse en conditions natives
- La séparation dépend de la charge nette, de la
structure et de la taille des protéines; - Ce type de séparation est utilisée lorsque la
structure de la protéine doit être conservée;
Pour quelles études sont utilisés les électrophorèses non dénaturantes?
- Études structurales et fonctionnelles: par exemple,
détection de l’interaction protéine-protéine
(complexe protéique); - Études enzymatiques: L’activité enzymatique peut
souvent être démontrée après l’électrophorèse.
Expliquez brièvement les principes d’électrophorèse en conditions dénaturantes
Uniformisation de la forme et de la densité de charge avec un détergent anionique (SDS: Sodium Dodécyl-Sulfate). La séparation se fait donc selon la masse moléculaire uniquement.
Que permet l’électrophorèse en conditions dénaturantes?
- La détermination de la masse moléculaire apparente des protéines
- De déterminer le nombre de sous-unités d’une protéine
- De déterminer la pureté d’un échantillon
En quoi la dégradation est différente de la dénaturation?
DÉGRADATION:
- IRRÉVERSIBLE
- Les protéases causent la perte de la structure primaire
- La protéine est dégradée
DÉNATURATION:
- Réversible
- Le changement de température ou de pH cause la perte des structures tertiaire et quaternaire
- La protéine est dénaturée
Nommez les agents dénaturants pour les protéines
- Chaleur, pH : déplie et linéarise les molécules
- Sodium Dodécyl-Sulfate: recouvre les molécules de
charges négatives - β-mercaptoéthanol + chaleur : rupture des ponts
disulfures formé entre les résidus Cys
Quelles sont les deux principales différences entre un système continue et discontinue?
Système continu : Un seul gel de polyacrylamide et un seul système de tampon.
Système discontinue: Superposition de deux gels de polyacrylamide et deux tampons de pH différent
Que permet l’ajout de deux tampons à pH différent dans un système discontinu?
Permet de concentrer les échantillons en une fine
bande, pour une meilleure résolution.
Quelles sont les deux gels retrouvés dans le système discontinu?
Gel de concentration / d’empilement (2-4%)
Gel de résolution / de séparation (7-15%)
À quoi sert l’utilisation de ces deux gels (empilement et séparation)?
Le gel d’empilement permet aux protéines
d’arriver en même temps au niveau du gel de
séparation. (En raison du pH du tampon, leur migration sera différente en raison de leur PI respectif)
Expliquer ce que l’on va observer comme processus avec les protéines en l’absence le gel d’empilement. Expliquez le processus du gel de séparation également
Gel d’empilement: En absence du gel d’empilement, les protéines n’entreraient pas en même temps dans le « gel de séparation » et formeraient des bandes larges et diffuses
Gel de séparation: Les protéines poursuivent leur migration vers l’anode mais le % d’acrylamide du gel étant plus élevé cette fois par rapport au gel d’empilement, elles se séparent selon leurs tailles (les petites protéines migrent plus vite).
Comment se fait la détermination de la taille d’une protéine à partir du gel d’électrophorèse ?
À l’aide de la courbe de standard du marqueur Broad Range
a) À partir de l’image ci-contre, dans quels puits se retrouvent les protéines IgG traitées au β-mercaptoéthanol ?
b) Que représentent les deux points de coupures dans les puits 2,3,4 ?
a) Puits 2,3,4
b) Le β-mercaptoéthanol a coupé deux protéines, une provenant d’une chaine lourde (la plus haute) et la chaine plus légère (la plus basse)
Vrai ou Faux
Tris-Tricine-SDS-PAGE est un autre type de SDS-PAGE. La tricine est souvent utilisée comme tampon en électrophorèse. Cette molécule est moins polarisée (plus négative) que la glycine et donc migre moins rapidement.
Faux, PLUS polarisée que la glycine donc migre plus rapidement.
La Tris-Tricine-SDS-PAGE est utilisée surtout pour quelle gamme de taille des protéines?
Inférieure à 30 kDa
La modification post-traductionnelle peut-elle affecter le poids moléculaire apparent sur SDS-PAGE? Si oui, quelles en sont les effets ?
Oui, les protéines peuvent donc se lier moins avec le SDS-PAGE
Nommez deux types de modifications post-traductionnelles
Phosphorylation et glycosylation
Pour l’électrophorèse à 2 dimensions, quelle est l’utilité de commencer une électrophorèse par isofocalisation comme 1er dimension? Et le SDS-PAGE comme 2e dimension?
Chaque protéine arrête de migrer
lorsque pH = pI. On connaît alors le pI de la protéine. La 2e dimension sert à déterminer à l’aide du SDS-PAGE la masse des protéines. Ainsi, cette méthode à deux dimensions permet de déterminer le PI et la masse moléculaire de la protéine.
Qu’est-ce qui est utilisé pour permettre l’isofocalisation des protéines ?
Un gel qui contient une série
d’ampholytes pour créer le gradient de pH
Quel réactif peut inhiber la réaction de polymérisation d’un gel de polyacrylamide ?
L’oxygène (l’air)
