Cours 7 - Plasmides Flashcards
Quelle est la structure d’un nucléotide?
Groupement phosphate
Base azotée (A,T,C,G,U)
Sucre
Quelle est la différence structurale entre l’ADN et l’ARN?
Leur sucre:
- ADN = Désoxyribose
- ARN = Ribose
Comment nomme-t-on un nucléotide et un acide nucléique en fonction de leur sucre?
Ribose:
- Nucléotide = Ribonucléotide
- Acide nucléique = Acide ribonucléique (ARN)
Désoxyribose:
- Nucléotide = Désoxyribonucléotide
- Acide nucléique = Acide désoxyribonucléique (ADN)
Quelles sont les bases nucléiques de la catégorie des bases pyrimidiques?
Cytosine
Thymine (ADN)
Uracile (ARN)
Quelles sont les bases nucléiques de la catégories des bases puriques?
Adénine
Guanine
Par quoi se définit la polarité des brins d’ADN?
Selon la position du phosphate sur le sucre
Quelles sont les 2 extrémités d’un brin d’ADN
Extrémité 5’-P
Extrémité 3’-OH
Quelles sont les propriétés de l’ADN?
Double brin
- Association par complémentarité des bases
- Bicaténaire
Orientation antiparallèle
- Brin : 5’ –> 3’
- Brin complémentaire: 3’ –> 5’
Quelle sorte de lien lie les bases entre elles?
Liaisons hydrogène
Quelles sont les règles de Chargaff?
Rapport 1 pour 1 entre les bases pyrimidiques et puriques
A/T = 1
G/C = 1
Purine/Pyrimidine = 1
Comment est-ce que le type de base influence les liaisons H?
Le nombre de liens H varient selon les bases:
- A et T = 2 liens H
- G et C = 3 liens H
Quelle liaison est la plus forte?
A-T ou G-C?
Quelle impact cette force aura lors de la dénaturation?
G-C est la liaison la plus forte puisqu’il y a 3 liens H (comparativement à 2 liens pour A-T)
Lors de la dénaturation, s’il y a plus de liaisons G-C, la température pour séparer les bases devra être plus élevée.
Expliquez la polymérisation de l’ADN
*Image diapo 10 du cours 7
1 - Il y a 1 copie d’ADN
2 - L’ADN est séparé en 2 brins
3 - Un brin complémentaire se formera sur chacun des 2 brins séparés
4 - Il y aura à présent 2 copies d’ADN
Qu’est-ce qui est la base des propriétés de dénaturation/renaturation de l’ADN, d’hybridation et de polymérisation de l’ADN?
La complémentarité des bases
Qu’est-ce que le génome?
L’ensemble du matériel génétique d’un être vivant.
Il regroupe les séquences codantes (les gènes) et les séquences non codantes.
Qu’est-ce qu’un gène
Séquence codant pour une protéine ou un ARN
Sous quelle forme est le génome de la plupart des êtres vivants?
ADN double brin
Quelle est l’unité pour mesurer la taille du génome?
pb = paires de bases
Qu’est-ce que les plasmides?
Molécules d’ADN qui sont:
- circulaires
- extrachromosomiques
- autoréplicatives
- non-essentielles à la survie des cellules, mais apportant des caractéristiques potentiellement avantageuses
Qu’est-ce qu’un vecteur de clonage?
Que contient-il?
C’est un plasmide recombiné qui, grâce à sa réplication autonome, permet de cloner des gènes.
C’est donc le plasmide dans lequel on insère notre gène d’intérêt.
Il contient:
- Origine de réplication + facteurs de réplication
- Marqueur de sélection –> Résistance à un antibiotique
- Site de clonage/de restriction
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction?
Enzyme capable de couper un fragment d’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides caractéristiques (site de restriction). Ce sont des ciseaux moléculaires.
Elle reconnaît une séquence spécifique de 4 à 8 nucléotides qui présentent un motif de palindrome.
VRAI OU FAUX
Une enzyme de restriction est exonucléase.
FAUX
Elle est endonucléase puisqu’elle coupe à l’intérieur du fragment d’ADN
Qu’est-ce qu’un palindrome?
Séquence d’acide nucléique qui est identique lorsqu’elle est lu dans le sens 5’–>3’ sur un brin et dans le sens
3’–>5’ sur le brin complémentaire
VRAI OU FAUX
Ce segment est un palindrome?
CGACGA
FAUX
Quelles sont les différentes extrémités de segments d’ADN lors de coupures?
Extrémités cohésives / protubérantes : forme de L ou L tête à l’envers
Extrémités franches : extrémité carrée
L’enzyme de restriction BamH I reconnait la séquence GGATCC et coupe après le premier “G”. Lorsque l’on coupe le plasmide pXYZ avec cette enzyme de restriction, quelle est la séquence de l’extrémité simple-brin protubérante dans l’orientation 5’ vers 3’ ?
a) GGATC
b) CTAG
c) CCTAG
d) GATC
e) GATCC
d) GATC
Quel est le rôle de la ligase?
Enzyme qui catalyse la formation du lien phosphodiester. Elle lie le gène d’intérêt au plasmide recombinant.
Comment le type d’extrémité influence la réussite du clonage conventionnel?
Si il y a présence d’extrémités franches, la ligase aura plus de difficulté à former le lien phosphodiester.
Après croissance, vous voulez purifier le plasmide pXYZ contenu dans les cellules de Escherichia coli par la méthode de lyse alcaline. Lequel des composés suivants est responsable de la dénaturation de l’ADN chromosomique ?
a) EDTA
b) NaOH
c) SDS
d) acétate de potassium
e) éthanol
b) NaOH
En raison des liaisons hydrogène entre les bases
Remettre dans l’ordre chronologique la préparation de plasmides.
a) Précipitation des plasmides
b) Précipitation des protéines et ADN chromosomique
c) Lyse des bactéries
d) Renaturation des plasmides
e) Centrifugation pour récolter les bactéries
e) - c) - d) - a) - b)
Donc:
Centrifugation pour récolter les bactéries
Lyse des bactéries
Renaturation des plasmides
Précipitation des protéines et ADN chromosomique
Précipitation des plasmides
En quoi constitue la lyse des bactéries dans la préparation de plasmides?
- Lyse alcaline avec SDS-NaOH
- Dénaturation des protéines et de l’ADN
Quels sont les rôles du SDS et du NaOH dans l’extraction de plasmides par lyse alcaline.
SDS: dénature les protéines + fragilise la membrane
NaOH: dénature les protéines et l’ADN
Quels sont les composés retrouvés dans le surnageant lors de la resuspension d’une extraction de plasmides par lyse alcaline? Quel est le rôle de chacun?
Tris: tampon, maintien le pH
Glucose: garde la pression osmotique
EDTA: inhibiteur des exonucléases = empêche la dégradation
VRAI OU FAUX
L’ADN peut se renaturer à la suite d’une dénaturation?
VRAI
Quels sont les facteurs qui permettent la dénaturation de l’ADN?
NaOH ou chaleur
Quels sont les facteurs qui permettent la renaturation de l’ADN
Baisse du pH ou refroidissement lent
VRAI OU FAUX
La vitesse de renaturation n’importe pas.
FAUX
Si le brin se renature trop brusquement, il risque de se renaturer incorrectement. Il y aura donc un réappariement incorrect.
VRAI OU FAUX
À la suite d’une centrifugation lors de l’extraction de plasmides par lyse alcaline, l’ADN plasmidique se retrouve dans le culot.
FAUX
Surnageant: ADN plasmidique
Culot: protéines + ADN chromosomique
Combien y aura-t-il de fragments si l’on coupe un plasmide à 2 sites de restriction?
2 coupures = 2 fragments
Qu’est-ce que l’électrophorèse?
Procédé permettant la séparation de molécules chargées sur la base de leur mouvement dans un champ électrique.
De quel(s) facteur(s) dépend la migration dans un gel d’électrophorèse?
- Taille de la molécule / masse moléculaire
–> Charge et forme = uniformisées
(La forme condensée migrera plus vite) - Support
–> Taille des pores (concentration et type) - Tampon
–> Force ionique et pH - Force du champ électrique
Dans quel sens est la migration dans une électrophorèse?
Négatif –> Positif
VRAI OU FAUX
Lors d’une électrophorèse, le ratio charge/masse est constant?
VRAI
VRAI OU FAUX
Les 4 nucléotides retrouvés dans l’ADN auront la même charge lors d’une électrophorèse
VRAI
Quelle charge portera l’ADN à pH ≥ 7?
Charge NÉGATIVE
Quelle est la charge du groupement phosphate d’un acide nucléique?
Charge NÉGATIVE
Quel est l’effet de la forme de l’ADN plasmidique sur la lecture du gel?
Lorsque l’ADN plasmidique est bien digéré et donc linéarisé, les bandes seront bien définies.
Lorsque l’ADN plasmidique est superenroulé, les bandes seront plus vagues et étendues.
Dans un tamis moléculaire, comment la taille des molécules affectera leur vitesse de migration?
Petites molécules: migration rapide
Grosses molécules: migration plus lente en raison de résistance
Afin de facilité la séparation de grosses molécules, devrions-nous augmenter ou diminuer la concentration du gel d’agarose?
Diminuer
VRAI OU FAUX
La distance de migration est directement proportionnelle au logarithme de la taille de l’ADN
FAUX
INVERSEMENT proportionnelle au log
VRAI OU FAUX
Sur le gel, l’intensité d’une bande indique l’abondance du fragment
VRAI
PLASMIDES:
Quel critère doit-on vérifier pour choisir le composé à mettre dans le milieu pour sélectionner les cellules qui seront transformées par un plasmide?
- On souhaite sélectionner le composé dont le plasmide est résistant.
- Il NE faut PAS sélectionner un composé dont la souche est naturellement résistante.
- Ne pas choisir un composé qui ne figure nulle part sur le plasmide.
PLASMIDES:
Lors d’une insertion d’un gène d’intérêt avec une seule enzyme de restriction, que doit-on vérifier pour faire le bon choix d’enzyme de restriction?
- Le gène d’intérêt ne doit pas être coupé par l’enzyme
- L’origine de réplication ne doit pas être coupée
PLASMIDES:
Si BamHI coupe le gène d’intérêt à 50 et à 1350 et que l’on insère ce gène d’intérêt à un plasmide de 4500 pb, quelle sera la taille du nouveau plasmide?
4500 + (1350-50) = 5800 pb
PLASMIDES:
Que faut-il vérifier lors du choix d’antibiotique à ajouter au milieu de culture pour cultiver les souches transformées avec le nouveau plasmide?
- On ne choisit pas le composé dont la souche était naturellement résistante
- Il faut choisir un composé dont le plasmide est résistant.
ATTENTION: il faut vérifier que l’enzyme de restriction choisie pour l’insertion ne coupe pas le gène de résistance. - Ne pas choisir un composé qui ne figure nulle part sur le plasmide.
