Cours 8 : les technologies de l'ADN Flashcards
Nucléases clivent quoi?
Lien phosphodiester
Exonucléase VS endonucléase
Enxo clive à PARTIR D’UNE EXTRÉMITÉ
Endo clive au MILIEU, produisant FRAGMENTS
Certaines endonucléase de RESTRICTION (ou enzymes de restrictions) coupent l’ADN à des endroits caractérisés par une…?
SÉQ DE NUCLÉOTIDES SPÉCIFIQUES : SITE DE RESTRICTION
Pk les bactéries ont des enzymes de restriction?
Servent à défense des bactéries contre virus en coupant ADN étranger en morceaux
** les enzymes de restriction sont nommées selon…?
l’espèce de bactérie desquelles ont été isolées (ex. EcoRI = Escherichia COli souche Ry13)
La plupart des enzymes de restriction reconnaissent des séqs…?
PALINDROMIQUES (se lient à l’envers comme à l’endroit)
Quand les enzymes de restriction coupent ADN, il peut y avoir création de bouts __________ ou de bouts ________.
- collants (sticky ends)
- francs
Une fois coupés par les endonucléases, les fragments d’ADN peuvent être séparés selon _________ par _________ sur ________. On applique un champs _________ et l’ADN chargé _______ migre vers le côté _________ du gel.
- taille
- électrophorèse
- d’Agarose
- électrique
- négativement
- positif
Comment les peut-on différencier les morceaux d’ADN par gèle d’agarose?
Le morceaux plus lourds migrent plus lentement : les morcx plus petits seront donc plus vers le + que les plus lourds
Quelle mol on utilise pour identifier les morcx d’ADN sur gel d’agarose?
bromure d’ethidium : mol fluorescente allant à l’INT DE DOUBLE HÉLICE
Au laboratoire, on peut faire la création d’ADN RECOMBIANT en joignant n’importe quel fragment COMPATIBLES d’ADN grâce à…?
UNE LIGASE
Bouts collant plus faciles à lier que bouts francs? Pk?
Oui, 100x, car bouts collants s’apparient, stabilisant interaction (francs = dépendants de collisions)
** afin de perpétuer et produire l’ADN recombinant en qtt illimitée, on insert l’ADN dans un _______ qui peut se ________ de façon _________. Ceci est couramment connu comme le “_______”
- vecteur
- réplique
- autonome
- cloning
** qu’est-ce qu’un “plasmide”?
CERCLE d’ADN pouvant se RÉPLIQUER DE FAÇON AUTONOME DANS ORGANISME HÔTE
Quelles sont les séquences d’ADN requises dans un plasmide?
- ORIGINE DE RÉPLICATION
- GÈNE DE SÉLECTION (RÉSISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES)
- SITE DE MULTICLONAGE
** À quoi sert le gène de sélection dans les plasmides?
à sélectionner spécifiquement les bactéries contenant le vecteur
** Est-ce que l’efficacité de la transformation (introduction d’un plasmide dans bactérie souche) est bonne? Comment on la détermine
NON : 1/2000
Détermine en mettant dans milieu avec antibiotique
** On peut utiliser clonage (insertion de plasmide) pour quoi en méd?
Création insuline et HGH (hormone de croissance)
Pour une réaction de polymérisation in vitro, on a tjrs besoin de…?
- aller de 5’ vers 3’
- AMORCES (oligonucléotide ADN ou ARN)
- BRIN MATRICE SIMPLE PAR DÉNATURATION THERMIQUE (ou pH, mais tjrs thermique qu’on utilise)
À quelle longueur d’onde on obtient ADN simple brin in vitro?
260 nm, car absorbe à cette longueur d’onde
Quels nucléotides vont se désassembler plus difficilement?
C-G!!! (OH)
Syn de “renaturation”
hybridation
On fait l’hybridation en baissant la température/ramenant aux conditions normales?
OUI!
** Comment se nomme la méthode de terminaison de chaîne la plus populaire?
Méthode de Sanger
Syn de “hybridation”
renaturation
** Quelle est la diff entre dNTP et ddNTP? Comment est-ce que ça affecte fct?
dNTP = désoxyribo… normal : élongation
ddNTP = didésoxiribo… a un H en 3’ au lieu d’un OH, ce qui empêche élongation : plus on le met tôt, plus l’élongation arrête tôt?
Quel composé permet la terminaison de la chaîne dans la méthode de séquençage de Sanger
ddNTP
** V/F?
On peut lire une séq d’ADN avec Sanger, en mettant ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP… ceux-ci, avec plsrs échantillons d’ADN, vont arrêter élongation à leur nucléotide respectif et on va pouvoir lire.
V!!!!!!
Les 3 étapes du cycle de PCR
1) séparation des brins : 98C
2) hybridation des amorces : 55C
3) synthèse par ADN polymérase d’E. coli : 37*C
** Peut-on utiliser une autre polymérase que celle de E. coli pour PCR?
Oui : Taql ADN polymérase : 70-72*C
** durée d’un cycle PCR
5 min
**plus les amorces sont longues, plus elles sont…?
Spécifiques (moins de chances de reconnaître plus d’un endroit dans génome)
Pour PCR, combien de copies d’ADN on a après 10, 20 et 30 cycles?
Environ : 1000, 1 000 000 et 1 000 000 000
Qu’est-ce que des STR (nmbr de nucléotides, répétées combien de fois, localisation des répétitions, nombre de répétitions habituelles pour un indiv)
- 2-6 nucléotides
- 5-200x
- sur UN MÊME LOCUS
- VARIE dans un locus pour CHAQUE INDIVIDU
Qu’est-ce que des VNTR (nmbr de nucléotides, répétées combien de fois, nombre de répétitions habituelles pour un indiv)
- 10-100 nucléotides
- 10-1500x
- VARIE dans un locus pour CHAQUE INDIVIDU
Les STR et VNTR, dans la vie, peuvent servir à quoi
DNA fingerprint
** Pour un test de paternité…
Si les deux copies VNTR et/ou STR n’ont pas le même nmbr de séqs répétées, on voit ______. Plus le STR ou VNTR testé est ____________, plus il est utile dans profilage génétique. En raison de plsrs polymorphismes, chaque personne a un ADN qui peut être _______ de l’ADN des autres individus.
- 2 bandes
- polymorphe
- distingué
