Cours 8 France Flashcards
Quelles sont les différents types d’ARN et en quelle proportion?
ARNm 1-5% – utile à la traduction en protéine – c’est le seul
ARN codant
ARNr 80-85%
ARNt 15-20%
C’est quoi l’ORF?
Open reading Frame – Région codante utile à la transcription de l’ADN en ARN
Comment passer de l’ADN à l’ARNm chez les eucaryotes?
DNA -> pre-mRNA -> mRNA
ARN pol II (ajout de la coiffe 5’) ->
Endonucléase (coupe extrémité??) ->
Polyadénylate pol (ajout de la queue poly-A) ->
Épissage (retrait des introns)
Quelles sont les différences entre l’ARN procaryote vs eucaryote?
Procaryote:
ARNm instable
Polycistronique (plusieurs protéines sur un ARMm)
Transcription et traduction couplés dans le cytoplasme
Eucaryote:
ARNm stable
Monocistronique
Transcription dans le noyau
Traduction dans le cytoplasme (exporter le mRNA)
Quel est le problème avec l’isolation d’ARN?
TRÈS facilement dégradable par les RNase
Très instable, car simple brin
Traitements spécialisés,
Matériel doit être RNase free (plastique jetable ou verrerie mega chauffée –180 pour 8h)
Espace réservvé
Gants…
Comment fait-on pour isoler de l’ARN?
- Récolte
- Lyse des cellules
- Extraction
- Centrifugation = Séparation en phase aqueuse et organique
- Reprise du surnageant (ARN)
- Précipitation
- Centrifugation == Tadaaa
Quelles sont quelques manière d’Analyser l’ARN?
- Electrophorèse (pour visualiser)
- Spectrophotomètre (pour concentrer)
- Fluorescence (pour marquer)
- Radioactivité (pour marquer)
- Bioanalyzer (électrophorèse + fluorescence)
À quoi sert l’isolation de la queue polyA?
-Clonage
- Librairie d’ADNc
- Expression
Isolement avec des billes, un colonne, de la résine…
Comment faire une hybridation de type Northern?
- Extraction d’ADN
- Electrophorèse
- Transfert sur membrane (simple brin)
- Hybridation (sonde)
- Révélation
À quoi servent les northern?
- Détection
- Révéler la présence de molécules d’ARN spécifiques
- Localisation et distribution
- Détecter les formes d’épissage des ARN
- Quantification
- Déterminer l’abondance
- Mesurer l’expression
- Comparer l’expression
Comment peut-on détecter un ARNm?
- Hybridation de l’ARN avec une sonde
- Digestion par la RNase (Protection)
- Électrophorèse et détection
À quoi sert la transcriptase inverse? (RT)
- Détecter un gène à partir de peu de molécules d’ARN
- Expression absolue ou relative
Comment se fait la RT?
En une étape: tous les réactifs d’un coup
Amorces + RT + ADN pol + autres
2 étapes:
RT = Amorces aléatoires + RT + autres = cDNA
qPCR = Amorces spécifiques + ADN pol + autres
À quoi sert la RT-qPCR?
Réaction de RT et PCR quantitatif
Sert à quantifier un ARN dans un échantillon
Choix d’un gène normalisateur (quantification et normalisation)
C’EST L’OUTIL LE PLUS PUISSANT, SENSIBLE ET QUANTITATIF POUR QUANTIFIER UN ARN
Utile à la Bio mol, Expression des gènes, Quantification, Diagnostic..
Quels sont les différents types d’ARN non codants régulateurs?
-sRNA (petits ARN)
- ARN antisens
- Riboswitch
- ARN interférence
- ARN CRISPR
Quelles sont les caractéristiques des sRNA?
Petits ARN régulateurs mais non codants
Fonction régulatrice: Activation ou inhibition de la traduction)
Dégradation de l’ARNm
Stable de 50-500 pb
Aidée par Hfq
Agit en trans ou en cis
Peut avoir plusieurs cibles
Qu’est-ce que les ARN interférants?
C’est un mode de régulation par les cellules
Permettent la dégradation de l’ARN double brin
- siRNA se lie au complexe RISC
- RISC va scanner l’ARNm, et si la séquence du siRNA lié est reconnu, RISC dégrade l’ARNm
Comment peut-on utiliser les ARN interférants pour des applications technologiques?
Pour empêcher l’expression d’un gène
Sert à :
- Analyser la fonction d’un gène,
-Analyser la voie métabolique,
-Thérapie (arrêt de la progression de la maladie)
C’est quoi CRISPR?
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
Séquences répétées intercalées de spacers
25 répétitions en moyenne (2-588)
Les séquences répétées proviennent de génomes viraux
Dans le SI, le système permet d’enpêcher des infections virales (qui affectent l’ADN, soit phage, plasmide…)
C’est quoi Cas
CRISPR ASsociated genes
6-20 gènes qui se lient à l’ADN ou l’ARN
Endonucléase, Exonucléase, Hélicase,,
C’est quoi la région leader?
Site AT-riche qui permet d’insérer les nouvelles régions spacer
Quel est le mécanisme de CRISPR-Cas?
- Transcription CRISPR en ARN
- Coupage en crRNA (plus petites unités d’ARN)
Les séquences répétées servent de site de reconnaissance pour couper
Les spacer sont des complémentaires aux ADN viraux ou plasmidiques - crRNA se lie à l’ARN guide et , avec Cas, vient dégrader ou arrêter la traduction des ARNm de l’ARN étranger
- Réduction ou annulation du pouvoir infectieux des phages ou des plasmides
En résumé:
Adaptation (ajout des protospacer au locus CRISPR)
Biogénèse (formation des crRNA)
Interférence (dégradation de l’ARNm étranger)
Combien de types de CRISPR?
6 types de CRISPR divisés en 2 classes
Type 1 est le plus répandu
45% des bactéries et 85% des archées ont un système CRISPR
Coment peut-on utiliser le système CRISPR-Cas?
Bactéries??
Pour le typage
Pour la vaccination ou l’industrie alimentaire
Comme antimicrobien
Par une coupure double brin
Cas9 + guide RNA + recombinase + ADN recombinant = Édition de génome
De quoi est formé le guide RNA?
TracrRNA et crRNA fusionnés
Ajoutés de CAs9
Permet de couper n’importe où
Comment réparer la coupure de Cas?
- Nonhomologous end-joining
Forme une mutation et codon stop prémature - Homology- directed repair
Precise gene editing
Une coupure double brin est létale pour les bactéries si elle n’est pas réparée
Est-ce que cas9 peut être modifiée?
Oui!
Modifier cas9 pour qu’elle ne coupe pas (deadCas9) –> réguler la transcription!
Utiliser une autre Cas –> couper qu’un seul brin ou couper de l’ADN
Donne des exemples d’applications à la santé de CRISPR-Cas9
Criblage = perte de fonction = stopper la croissance d’une tumeur
Activation du génome = stopper la croissance d’une tumeur
Réparation du génome = Cure maladie génétique ou facteur
Dégradation du génome = Corriger une mutation dominante
Répression génomique = réprimer des oncogènes
