Cours 7 Szatmari¸

Question 1

Quelles sont les étapes du clonage moléculaire?

Answer 1

1- Digérer le fragment d’ADN d’intérêt par des enzymes de restriction (préparation de l’insert pour le clonage

2- Digérer le vecteur de clonage par des enzymes de restriction

3-Liguer l’insert et le vecteur = forme un plasmide recombinant

4- Transformer le plasmide dans cellules compétentes bactériennes

5-Isoler le plasmide recombinant et confirmer la construction ADN par la digestion ou PCR ou séquençage

Question 2

À quoi sert le clonage moléculaire?

Answer 2

1-Surexprimer une protéine homologue ou hétérologue

2- Exprimer des gènes pour des études (génétique, physiologie..)

3- Fusionner des promoteurs pour étudier des profils transcriptionnels

4-Criblage génétique

5-Séquençage

Question 3

C’est quoi un gène?

Answer 3

Une séquence d’ADN qui code pour une protéine: Start à Stop

Question 4

Équivalent des gènes chez les eucaryote?

Answer 4

Interruption des régions codantes par des introns

Boîte de Kozak ressemble à RBS

RBS = IRES qui provient de gènes viraux de mammifères

IRES sert à surexprimer des protéines en cellules mammifères

Question 5

D’où provient l’insert pour le clonage?

Answer 5

Produit PCR

Plasmide recombinant

Source d’ADN naturelle (virus/phage/chromosome)

Gène synthétique

Question 6

Que doit-on considérer lors du choix d’amorce?

Answer 6

Tm, longueur, structure secondaire

sites d’appariement qui permettront d’amplifier tout le gène d’intérêt (on doit donc ajouter des séquences de reconnaissance en aval et en amont du gène d’intérêt)

Question 7

Quelles sont les endonucléases?

Answer 7

Enzymes de restriction qui coupent à l’intérieur des séquences d’ADN sans dégrader les extrémités

Il faut rajouter les nucléotides en 5’ des sites de restriction (généralement 6 nucléotides)

Question 8

Comment seraient construit des amorces comme outil de bio mol?

Answer 8

Amorce Forward:
Nucléotides extra 5’ -> Site de restriction -> RBS -> Section homologue au gène

Amorce Reverse:
Nucléotides extra 5’ -> Site de restriction -> Codon STOP -> Fusion traductionnelle (his-tag) -> Section homologue au gène

Question 9

Utilité des amorces

Answer 9

Amplifier les gènes à cloner

Ajouter des sites de restriction

Ajouter d’autres séquences aux produits PCR

Réaliser une mutagénèse dirigée

Question 10

Revoir la mutagénèse dirigée

Answer 10

p.15-16