Cours 4 - Mécanisme de la transcription Flashcards
En quoi diffère la transcription de la réplication ?
- Le brin est constitué de ribonucléotide
- Ne requiert pas d’amorce
- L’ARN ne reste pas apparié au brin matrice
- Moins fidèle que la réplication (logique car moins important que la transmission soit fidèle car ce n’est pas dédié aux cellules filles, pas d’erreur permanente)
Quels éléments sont reconnus par σ70 (qui lui est divisé en 4 régions) ?
- La région 2 et 4 reconnaissent les éléments -10 et -35
(La région 4 porte 2 hélice (Une ayant un grand sillon ADN élément -35 et une autre située en travers au-dessus du sillon qui établit des contacts avec squelette ADN) formant un motif hélice-coude-hélice)
(Élément -10 : aussi reconnu par hélice α (région 2) : interaction moins caractérisée et + complexe) - Élément ‘-10 allongé’ (lorsque présent): reconnu par hélice α (région 3)
- Élément ‘discriminateur’ (lorsque présent): reconnu par région 1.2
- Noter que l’élément UP n’est pas reconnu par une hélice alpha, mais plutôt par le domaine C-terminal étendu (αCTD) de sous-unité alpha de la polymérase (αCTD relié à αNTD par un pont protéique flexible)
- Régions σ liant ADN (σ2 et σ4): exposées à la surface de l’enzyme et non enchâssées
Quels sont les les canaux d’entrées et de sorties dans l’ArN polymérase (5) ?
- Canal d’entrée des NTPs au centre actif
- Canal de sortie de l’ARN produit
- 3 autres canaux: permettent l’entrée et sortie de l’ADN (canal aval (ADN double brin pénètre par-là), canal NT (fait sortir rapidement le brin sens non transcrit), canal brin matrice T (où sort le brin matrice transcrit))
RAPPEL
Brins d’ADN se séparent à partir de +3 dans centre catalytique
Double hélice se reforme en -11
2 changements structuraux importants :
1- La fermeture des mâchoires de l’enzyme sur la double hélice d’ADN
2- Déplacement de la région N-terminale 1.1 de sigma (qui bloque l’ADN dans le site catalytique lorsque l’enzyme n’a pas encore séparer les deux brins), cela permet à l’ADN d’accéder au canal aval.
Quels sont les modes de déplacement de la polymérase lors de la synthèse abortive ?
- Le modèle « d’excursion transitoire » : Cycles translocation ARN polymérase avant/arrière
- Le modèle « inchworming » (chenille arpenteuse) (avec hypothèse que la polymérase soit séparée en 2 domaines relié par un pont flexible) : Permet au module (site actif) de se déplacer vers l’aval en synthétisant court transcrit avant de se rétracter dans le corps de l’enzyme (promoteur)
- Le modèle de compression (« scrunching ») (le modèle le + probable) : ADN en aval tiré et replié à l’intérieur de l’enzyme. L’ADN s’y accumule (boucles simple brin)
Qui joue le rôle de mime moléculaire dans la polymérase et en quoi cela consiste (chez les procaryotes)?
C’est la région du lien ¾ qui imite l’ARN (en jouant un rôle de mime moléculaire) bloque la sortie ARN, il va donc s’éjecter de la région 3/4, ce qui est probablement responsable de la diminution de la force de liaison de sigma à l’enzyme.
Quels sont les deux fonctions correctrices lors de l’élongation (chez les procaryotes) ?
1- Correction pyrophospholytique : Catalyse enlèvement 1 ribonucléotide incorrect par incorporation PPi (P2O74-) afin d’incorporer un nouveau nucléotide par la suite.
2- Correction hydrolytique : Enzyme recule un ou plusieurs nucléotides et clive ARN (c’est un peu plus long comme processus)
Quels sont les 2 types de temrinateurs chez les bactéries ?
1- Rho-dépendant : nécessite protéine Rho pour provoquer terminaison (Il se fixe à l’ARN simple brin dès qu’il sort de l’Arn polymérase sur le site rut (environ 70 nucléotides sans structures secondaire, riche en C (situé près de la fin d’un gène). Rho possède une activité ATPase. Elle utilise l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP pour la terminaison.)
2- Rho-indépendant : provoque terminaison sans autres facteurs (Courte séquence répétée inversée (palindrome) + paires de bases A-T (≈8)) (L’ARN en transcription forme une structure tige-boucle qui désorganise le complexe d’élongation et qui créer la terminaison)
Quels sont les 3 polymérases principales chez les eucaryotes et leur rôle ? Quels facteurs supplémentaires sont aussi requis pour la transcription ?
Pol I: code pour les ARNr
Pol II: code pour la plupart des gènes
Pol III: code pour les ARNt et les ARN 5s
i) Protéines régulatrices liant ADN (facteurs de transcription/régulateurs)
ii) Complexe « Médiateur »
iii) Enzymes modification de la chromatine
Quel est l’ordre de formation du complexe de préinitiation dans la transcription chez les eucaryotes ?
1- Reconnaissance de la boite TATA (-30) par la TFIID (étape critique pour l’initiation). TFIID est un complexe de sous-unité comprenant TBP (TATA binding protein) et TAFs (TBP associated factor’s). Le complexe TBP-TATA fournit la plateforme pour attirer sur le promoteur d’autres FGTs + Pol II.
2- TFIIA (interagit avec TBP de TFIID et stabilise le complexe, mais lie PAS avec ADN) : élimine interaction de répresseurs avec TBP qui empêchent formation du complexe d’initiation (PIC) et agit comme co-activateur pour certains activateurs. Encodé par deux gènes distincts: TFIIAα/β (TOA1): sous-unité 55kDa et TFIIAγ (TOA2): sous-unité 12kDa
3- TFIIB (interagit avec TBP ET avec l’ADN) : Interactions base-spécifiques avec le grand sillon en amont (BRE) et le petit sillon en aval de TATA. IMPORTANT : Aussi: contacts avec Pol II dans complexe préinitiation (Des segments TFIIB insérés dans canal de sortie ARN et gorge site actif de polymérase = Fait le lien entre TBP lié à la boîte TATA et la Pol II)
4- TFIIF déjà associé à la polymérase (une fois que TFIIH va être lié, c’est là que la polymérase pourra débuter son activité) : Chez l’humain, elle a deux sous-unité essentielles (RAP74 et RAP30). Chez la levure, elle a leur équivalent (Tfg1 et Tfg2), puis une autre non-essentielle (Tfg3). La liaison de Pol II – TFIIF stabilise le complexe ADN-TBP-TFIIB (nécessaire avant l’arrivé des deux autres). De plus, on croit que l’ADN s’enroule 1x autour complexe préinitiation; TFIIF contribuerait maintenir enroulement serré ADN.
5- TFIIE (2 sous-unités) = se lie ensuite au complexe = recrute et régule TFIIH
6- TFIIH (très important : contrôle transition complexe préinitiation (fermé) au complexe ouvert (dépendant de l’ATP)) : C’est le plus gros et le plus complexe des FGTs : 10 sous-unités. Deux sous-unités TFIIH (XPD et XPB) ont une activité ATPase (hélicase) + activité protéine kinase : Rôle dans fusion du promoteur et dans le détachement de PolII du promoteur + Impliqué dans réparation ADN (excision de nucléotide: NER (‘nucleotide excision repair’)
La libération du promoteur chez les eucaryotes implique deux étapes absentes chez les bactéries, quelles sont-elles
1- Nécessite l’hydrolyse de l’ATP (en + de l’hydrolyse de l’ATP pour fusionner l’ADN par la TFIIH)
2- La phosphorylation de la Pol II (la plus grande sous unité de Pol II est un domaine C-terminal (CTD) en « queue ». C’est une série de répétition (52 chez l’homme) heptapeptide (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser). La phosphorylation du CTD aide Pol II à se défaire de la plupart des FGT (les sérines en positions 2 et 5 sont très importante pour tout ça).
Quels TAFS se lient au promoteur dans le complexe TBP-ADN ?
TAF2 et TAF62. Ils sont vraiment intéressant car ils ont des similitudes structurales avec les histones (on propose donc qu’ils se lient comme les histones H3/H4 à l’ADN). Ces TAFs de type ‘histones’ sont présents dans TFIID mais aussi en association avec enzymes modification des histones (complexe SAGA (levure))
Faites un résumé de la transcription chez Pol I et Pol III
Pol I est nécessaire pour l’expression d’un seul gène : celui qui va coder pours les précurseur des ARNr.
- Son promoteur est constitué de 2 parties : un promoteur central + un élément de contrôle en amont (UCE).
- Deux autres facteurs requis pour initiation : SL1 et UBF
SL1 (se compare à TFIID) : comprend TBP + 3 TAFs spécifiques à la Pol I= fixe promoteur central + requiert UBF pour liaison.
UBF se lie UCE, il recrute SL1 et stimule la transcription en recrutant Pol I.
Le cœur du promoteur de Pol III
- Les promoteurs de Pol III existent sous différentes formes. Certains contiennent boîte A et boîte B séparées par court élément (ex : gènes ARNt). D’autres portent boîte A et boîte C (ex : gène codant ARNr 5S). D’autres portent boîte TATA !
- La transcription par la Pol II nécessite des FTGs en + de la Pol II :
TFIIIB et TFIIIC (gènes ARNt)
TFIIIB, TFIIIC et TFIIIA (gène ARNr 5S)
L’ordre de placement est à l’envers selon l’ordre alphabétique (CBA)
Quels sont les facteurs d’élongation parlés en classe et leur rôle ?
*Ces enzymes sont recrutées au CTD de Pol II, et ils préfèrent la forme phosphorylée de celle-ci :
- CTD Pol II est très long (≈7x longueur Pol II)
- Permet à CTD de lier plusieurs composants machinerie élongation + maturation: les met en contact avec ARN
- La kinase P-TEFB, qui est transporté par la polymérase par des activateurs transcriptionnels, est importante dans la stimulation de l’Élongation car elle phosphoryle le résidu Sérine 2 dans CTD. Cette étape corrèle avec l’élongation. P-TEFb recrute, phosphoryle + active autre protéine : TAT-SF1 = facteur d’élongation
Il y a aussi ELL, un autre facteurs d’élongation qui se lie à Pol II durant la phase d’élongation et améliore sa processivité en supprimant les arrêts temporaires de l’enzyme (fréquent).
TFIIS : stimule le taux d’élongation en diminuant le temps de pause de Pol II sur les séquences qui ralentissent sa progression. Il permet aussi de contribuer à la vérification de séquence par Pol II en stimulant son activité RNase (comparable à la correction hydrolytique des bactéries stimulé par Gre). C’est une stratégie alternative pour éliminer les bases incorrectes par l’hydrolyse limité de l’ARN.
Quel est le rôle du facteur FACT ?
Il faut comprendre que la chromatine gène la transcription In vivo
Le facteur FACT (facilitates chromatines transcription) est un hétérodimère de 2 protéine très conservée : Spt16 et SSRP1
1- Spt16: lie à H2A/H2B SSRP1: lie tétramère H3/H4
2- Devant Pol II en transcription : FACT extrait 1 dimère H2A/H2B
3- Permet à Pol II passer ce nucléosome
4- FACT: possède aussi activité chaperon d’histone qui permet réinsérer H2A/H2B dans l’hexamère d’histones derrière Pol II
Quelles sont les modifications subites par l’ARN avant d’être exportée vers le cytoplasme ?
1- Formation de la coiffe à l’extrémité 5’ (dès que l’ARN émerge du canal de sortie de Pol II): Ajout guanine (G) méthylée à extrémité 5’ ARN via une liaison particulière 5’-5’ impliquant 3 phosphates (3 étapes).
1ère étape : groupe phosphate enlevé extrémité 5’ ARN
2ème étape : ajout nucléotide GMP
3ème étape : méthylation du GMP
Rôle de la coiffe : Stabilise l’ARNm (protège ribonucléase), exporte l’ARNm dans le cytoplasme et permet le recrutement de ribosome.
Après l’ajout de la coiffe : Il y a une déphosphorylation de serine 5 du CTD pour dissocier la machinerie d’assemblage de la coiffe et une phosphorylation de la sérine 2 du CTD pour assembler la machinerie d’épissage.
2- L’épissage de l’ARN (complexe, vu dans chapitre 13)
3- La polyadénylation à l’extrémité 3’ (intimement lié à la terminaison) : Lorsque Pol II rencontre la fin d’un gène, il y a une séquence spécifique AATAAA qui sera transcrite en AAUAAA. Cela stimule le transfert d’enzymes de polyadénylation du CTD à l’ARN. Conduit à 4 événements :
1. Clivage de l’ARNm en aval de AAUAAA par CPSF et encouragé par CstF (Deux complexes protéiques transportés par Pol II (CTD) lorsqu’elle s’approche de fin du gène, les signaux de Poly-A stimulent le transfert de CPSF et CstF pour cliver)
2. Ajout d’un grand nombre de résidus adénine à son extrémité 3’ (CPSF recrute la Poly-A-polymérase qui va ajouter environ 200 adénines, pour ensuite recruter des PABP (poly (a) binding proteins) qui vont exporter l’ARNm matrue au cytoplasme)
3. Dégradation de l’ARN encore associé à l’ARN Pol II (plusieurs milliers de nucléotides) par une enzyme dégradant 2ème ARN dès qu’il émerge de la polymérase. 2 Modèles :
- Modèle de terminaison : Torpille (modèle préféré)
L’extrémité du 2e ARN est dépourvue de coiffe, cet ARN est reconnu par RNase = Rat1 (levure) ou Xrn2 (humain)/positionnées par Rtt103 (CTD). Rat1 est très processive; elle dégrade rapidement ARN 5’/3’ pour rattraper la Pol II en transcription.
Terminaison : ne requiert aucune interaction spécifique entre Rat1 et Pol II
(Rat1/Xrn2: pousserait Pol II vers avant et/ou arracherait transcrit naissant)
- Modèle de terminaison allostérique : la terminaison dépendrait de modifications structurales de Pol II qui réduirait le caractère processif de Pol II et mènerait à sa terminaison spontanée. Ce modèle est liée à la polyadénylation. Le tout serait provoquée par transfert enzymes modifiant l’ARN (CPSF et CstF) de queue CTD Pol II à ARN.
- Terminaison de la transcription
