Cours 3 : Techniques d'amplification des acides nucléiques Flashcards
Quel est le but de la PCR?
Générer une grande quantité d’ADN à partir d’une seule copie
Sur quoi la PCR est basée?
Sur la réplication de l’ADN
Lors de la PCR, combien d’amorces sont utilisées?
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Pour la PCR, que délimitent les amorces?
La séquence à amplifier
Quelles sont les 4 étapes de la PCR?
1) ADN initial
2) Dénaturation
3) Hybridation
4) Synthèse
Quel est l’intervalle de température de fusion permettant l’hybridation lors de la PCR?
55 et 65 degrés Celsius
Qu’est-ce que la température de fusion?
Température à laquelle 50% des molécules sont sous forme double brin
Environ combien de cycles d’amplifications sont fait pendant la PCR?
25 à 45 cycles de dénaturation, hybridation, élongation
Quelle est la polymérase la plus utilisée pour la PCR?
La taq
Quelle est la demi-vie enzymatique de la taq?
40 minutes à 72 degrés Celsius
Pourquoi, dans la PCR, la dénaturation initiale est beaucoup plus longue que les autres dénaturations?
Parce qu’il faut séparer le génome au complet
Quel produit nous permet de visualiser l’ADN dans un résultat de PCR sur gel d’agarose?
Le bromure d’éthidium
Comment fonctionne la détection des produits de PCR par ESI-MS?
On travaille avec la masse des fragments et non leur taille, en connaissant la composition en acides nucléiques du fragment, on est capable de connaître leur masse
Quels sont les éléments nécessaires pour faire une PCR (6)?
1) Gel d’agarose
2) Polymérase
3) Amorces
4) Tampon
5) Machine
6) dNTP
Vrai ou faux : La coloration au bromure d’éthidium n’est pas quantitative
Vrai (pas moyen de savoir la quantité de l’échantillon de départ si on ne la connait pas
Vrai ou faux : La PCR est très précise?
Faux, puisque c’est seulement de la différenciation basée sur la taille
Quel est l’acronyme de la PCR en temps réel?
qPCR
Sur quoi est basé la qPCR?
Détection de l’amplification basée l’utilisation de la fluorescence
Que combine la qPCR?
L’amplification et la détection
Lors de la qPCR, qu’est-ce que le Ct?
Le moment où la fluorescence devient significative (quand le signal est un log au dessus du bruit de fond)
Quel fluorescent est utilisé pour la qPCR?
SYBR green
Comment fonctionne le SYBR Green?
Il y a émission de fluorescence quand il va s’intercaler dans un double brin d’ADN et plus la quantité d’ADN double brin augmente plus la fluorescence augmente
Plus l’échantillon augmente, plus il y a de fluorescence donc plus le Ct va être ____
Bas (parce que ça progresse plus rapidement)
Qu’est-ce que la courbe de dissociation lors de la qPCR?
Si on augmente la température les deux brins d’ADN vont se séparer ce qui va faire diminuer la fluorescence jusqu’à la faire diminuer d’un coup
Pour la qPCR, que donne la dérivée au pont d’inflection?
Un pic qui donne la température à laquelle la moitié des fragments vont être dénaturés
Comment fonctionne la qPCR avec une sonde à hydrolyse?
On a une sonde avec un rapporteur et un quencher dans la région qu’on veut et il n’y a pas de signal fluorescent émis par le rapporteur quand la sonde est intact.
Quand la sont est dégradée par Pol, le rapporteur fluorescent est libéré
Que permet la qPCR avec une sonde à hydrolyse?
De faire de la quantification (quand on a un échantillon inconnu)
Quelle est la différence entre la PCR classique et la qPCR?
qPCR = on regarde dans la phase exponentielle = permet de faire de la quantification
PCR classique = on regarde à la fin (le plateau) = permet pas de faire de quantification
Qu’est-ce que la RT-PCR?
La reverse transcriptase PCR (amplification à partir de l’ARN)
En absence de contrôle interne, que peut signifier un résultat négatif de PCR?
Une quantité d’ADN recherché sous le seuil de détection
Quels sont les 3 types de contamination d’un échantillon négatif lors de la PCR?
1) Contamination inter-échantillon pré-PCR
2) Contamination des réactifs ou des échantillons par de l’ADN amplifié provenant d’amplifications précédentes
3) Contamination inter-échantillons post-PCR lors de la détection
Quelles sont les 3 façon d’éviter la contamination lors de la PCR?
1) Ajouter des contrôles négatifs à chaque analyse
2) Aliquoter les réactifs en petites quantités
3) Utilisation de pièces séparées
Qu’est-ce que la LAMP?
Une technique d’amplification isotherme de l’ADN facilitée par boucle
Dans la LAMP, que fait la polymérase avec le brin d’ADN?
Elle le déplace et non le dégrade
Vrai ou faux : pour la LAMP, tout ce fait à la même température?
Vrai car c’est des déplacements de brin et non de la dégradation
Pour la LAMP, combien d’amorces différentes sont utilisées?
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Quelle technique est la RPA?
Technique d’amplification isotherme de l’ADN utilisant la recombinaison
Quel matériel utilise la RPA (3)?
1) Une recombinase
2) Une protéine de liaison à l’ADN simple brin
3) Une ADN polymérase avec activité de déplacement de brin
Quel est l’avantage d’utiliser de l’ARN comme cible?
L’ARN pol fait des centaines de copies dont on peut augmenter la sensibilité et l’ARN se dégrade plus rapidement donc permet de savoir si la bactérie est vivante ou non
