Cours 3 : Techniques d'amplification des acides nucléiques

Question 1

Quel est le but de la PCR?

Answer 1

Générer une grande quantité d’ADN à partir d’une seule copie

Question 2

Sur quoi la PCR est basée?

Answer 2

Sur la réplication de l’ADN

Question 3

Lors de la PCR, combien d’amorces sont utilisées?

Answer 3

2

Question 4

Pour la PCR, que délimitent les amorces?

Answer 4

La séquence à amplifier

Question 5

Quelles sont les 4 étapes de la PCR?

Answer 5

1) ADN initial
2) Dénaturation
3) Hybridation
4) Synthèse

Question 6

Quel est l’intervalle de température de fusion permettant l’hybridation lors de la PCR?

Answer 6

55 et 65 degrés Celsius

Question 7

Qu’est-ce que la température de fusion?

Answer 7

Température à laquelle 50% des molécules sont sous forme double brin

Question 8

Environ combien de cycles d’amplifications sont fait pendant la PCR?

Answer 8

25 à 45 cycles de dénaturation, hybridation, élongation

Question 9

Quelle est la polymérase la plus utilisée pour la PCR?

Answer 9

La taq

Question 10

Quelle est la demi-vie enzymatique de la taq?

Answer 10

40 minutes à 72 degrés Celsius

Question 11

Pourquoi, dans la PCR, la dénaturation initiale est beaucoup plus longue que les autres dénaturations?

Answer 11

Parce qu’il faut séparer le génome au complet

Question 12

Quel produit nous permet de visualiser l’ADN dans un résultat de PCR sur gel d’agarose?

Answer 12

Le bromure d’éthidium

Question 13

Comment fonctionne la détection des produits de PCR par ESI-MS?

Answer 13

On travaille avec la masse des fragments et non leur taille, en connaissant la composition en acides nucléiques du fragment, on est capable de connaître leur masse

Question 14

Quels sont les éléments nécessaires pour faire une PCR (6)?

Answer 14

1) Gel d’agarose
2) Polymérase
3) Amorces
4) Tampon
5) Machine
6) dNTP

Question 15

Vrai ou faux : La coloration au bromure d’éthidium n’est pas quantitative

Answer 15

Vrai (pas moyen de savoir la quantité de l’échantillon de départ si on ne la connait pas

Question 16

Vrai ou faux : La PCR est très précise?

Answer 16

Faux, puisque c’est seulement de la différenciation basée sur la taille

Question 17

Quel est l’acronyme de la PCR en temps réel?

Answer 17

qPCR

Question 18

Sur quoi est basé la qPCR?

Answer 18

Détection de l’amplification basée l’utilisation de la fluorescence

Question 19

Que combine la qPCR?

Answer 19

L’amplification et la détection

Question 20

Lors de la qPCR, qu’est-ce que le Ct?

Answer 20

Le moment où la fluorescence devient significative (quand le signal est un log au dessus du bruit de fond)

Question 21

Quel fluorescent est utilisé pour la qPCR?

Answer 21

SYBR green

Question 22

Comment fonctionne le SYBR Green?

Answer 22

Il y a émission de fluorescence quand il va s’intercaler dans un double brin d’ADN et plus la quantité d’ADN double brin augmente plus la fluorescence augmente

Question 23

Plus l’échantillon augmente, plus il y a de fluorescence donc plus le Ct va être ____

Answer 23

Bas (parce que ça progresse plus rapidement)

Question 24

Qu’est-ce que la courbe de dissociation lors de la qPCR?

Answer 24

Si on augmente la température les deux brins d’ADN vont se séparer ce qui va faire diminuer la fluorescence jusqu’à la faire diminuer d’un coup

Question 25

Pour la qPCR, que donne la dérivée au pont d’inflection?

Answer 25

Un pic qui donne la température à laquelle la moitié des fragments vont être dénaturés

Question 26

Comment fonctionne la qPCR avec une sonde à hydrolyse?

Answer 26

On a une sonde avec un rapporteur et un quencher dans la région qu’on veut et il n’y a pas de signal fluorescent émis par le rapporteur quand la sonde est intact.
Quand la sont est dégradée par Pol, le rapporteur fluorescent est libéré

Question 27

Que permet la qPCR avec une sonde à hydrolyse?

Answer 27

De faire de la quantification (quand on a un échantillon inconnu)

Question 28

Quelle est la différence entre la PCR classique et la qPCR?

Answer 28

qPCR = on regarde dans la phase exponentielle = permet de faire de la quantification
PCR classique = on regarde à la fin (le plateau) = permet pas de faire de quantification

Question 29

Qu’est-ce que la RT-PCR?

Answer 29

La reverse transcriptase PCR (amplification à partir de l’ARN)

Question 30

En absence de contrôle interne, que peut signifier un résultat négatif de PCR?

Answer 30

Une quantité d’ADN recherché sous le seuil de détection

Question 31

Quels sont les 3 types de contamination d’un échantillon négatif lors de la PCR?

Answer 31

1) Contamination inter-échantillon pré-PCR
2) Contamination des réactifs ou des échantillons par de l’ADN amplifié provenant d’amplifications précédentes
3) Contamination inter-échantillons post-PCR lors de la détection

Question 32

Quelles sont les 3 façon d’éviter la contamination lors de la PCR?

Answer 32

1) Ajouter des contrôles négatifs à chaque analyse
2) Aliquoter les réactifs en petites quantités
3) Utilisation de pièces séparées

Question 33

Qu’est-ce que la LAMP?

Answer 33

Une technique d’amplification isotherme de l’ADN facilitée par boucle

Question 34

Dans la LAMP, que fait la polymérase avec le brin d’ADN?

Answer 34

Elle le déplace et non le dégrade

Question 35

Vrai ou faux : pour la LAMP, tout ce fait à la même température?

Answer 35

Vrai car c’est des déplacements de brin et non de la dégradation

Question 36

Pour la LAMP, combien d’amorces différentes sont utilisées?

Answer 36

4

Question 37

Quelle technique est la RPA?

Answer 37

Technique d’amplification isotherme de l’ADN utilisant la recombinaison

Question 38

Quel matériel utilise la RPA (3)?

Answer 38

1) Une recombinase
2) Une protéine de liaison à l’ADN simple brin
3) Une ADN polymérase avec activité de déplacement de brin

Question 39

Quel est l’avantage d’utiliser de l’ARN comme cible?

Answer 39

L’ARN pol fait des centaines de copies dont on peut augmenter la sensibilité et l’ARN se dégrade plus rapidement donc permet de savoir si la bactérie est vivante ou non