Cours 2 : ADN; détection, hybridation et applications

Question 1

Quel phosphate demeure dans la chaine d’ADN lorsqu’on fait un marquage radioactif?

Answer 1

Le phosphate alpha (1er phosphate)

Question 2

À quoi servent les radioisotopes 32p et 35s?

Answer 2

Il servent à marquer le phosphate alpha pour rendre l’ADN radioactif durant sa biosynthèse

Question 3

Pourquoi est-il plus avantageux d’utiliser le radioisotope 35s plutôt que le 32p?

Answer 3

Parce que sa demi-vie est plus longue et son énergie d’émission plus faible

Question 4

Quelles sont les deux méthodes pour mesurer la radioactivité?

Answer 4

1) Le comptage à scintillation

2) L’autoradiographie

Question 5

Dans quelle situation il faut utiliser le comptage à scintillation et dans quelle autre l’autoragiographie?

Answer 5

Comptage à scintillation = si l’échantillon est dans un liquide ou sur un morceau de papier filtre

Autoradiographie = si l’échantillon est dans un gel

Question 6

Qu’est-ce que les scintillants vont émettent lors du comptage à scintillation?

Answer 6

Des pulses de lumières

Question 7

Dans quel cas le comptage à scintillation est très utile?

Answer 7

Pour mesurer le taux de réplication de l’ADN dans différentes souches bactériennes

Question 8

Sur quoi on peut voir les bandes d’ADN lors de l’autoradiographie?

Answer 8

Sur un film (buvard) qui a été posé sur le gel pour faire un transfert

Question 9

Quand-est-ce que la fluorescence survient pour la détection de l’ADN?

Answer 9

Lorsqu’une molécule absorbe de la lumière d’une longueur d’onde particulière et émet de la lumière de plus faible énergie à une longueur d’onde plus longue

Question 10

Quelle technique est plus dispendieuse et moins rapide entre la méthode de marquage aux radioisotopes ou la fluorescence?

Answer 10

La méthode de marquage aux radioisotopes

Question 11

Vrai ou faux : Lors du marquage fluorescent, chaque nucléotide a une couleur appropriée à lui

Answer 11

Vrai

Question 12

Quels sont les deux marqueurs moléculaires très utilisés pour marquer l’ADN?

Answer 12

1) La biotine

2) La digoxigénine

Question 13

Comment fonctionne le marquage chimique de l’ADN avec la biotine ou la digoxigénine?

Answer 13

On met un linker sur l’uracile (dUTP), ce qui permet de le coupler à la biotine, qui va elle se lier à l’avidine qui va activer un X-Phos qui va se lier à l’oxygène pour produire un colorant bleu (révèle la présence d’un dUTP)

Question 14

La température de dénaturation ou de fusion d’une molécule d’ADN donnée est définie comme étant la température _____

Answer 14

Au milieu de la courbe de dénaturation

Question 15

Par quelle technique peut-on former de l’ADN hybride?

Answer 15

Hybridation

Question 16

Qu’est-ce qu’un ADN hybride?

Answer 16

il s’agit de deux molécules d’ADN simple-brin apparentés qui sont mélangés ensemble dans la même solution (ils s’hybrident ensemble)

Question 17

Qu’est-ce qu’un hybride imparfait?

Answer 17

Deux brins qui viennent de deux micro-organismes différents qui s’hybrident ensemble mais ne diffèrent que par une ou deux positions

Question 18

Dans quel cas l’hybridation pourrait être utile?

Answer 18

Elle permet de déterminer à quel point deux molécules d’ADN sont reliées au niveau de leur séquence ou encore l’isolement d’un gène pour son clonage (isoler des fragments d’ADN du même gène mais provenant d’une autre espèce si l’homologie des molécules simple-brin est assez forte)

Question 19

Comment fonctionne l’hybridation de type southern?

Answer 19

On prend le gel d’agarose après électrophorèse, on dénature tous les fragments d’ADN in situ donc à leur position et on prend une sonde simple brin qui va aller se coller au fragment simple brin d’intérêt par complémentarité

Question 20

À quelle question répond le zoo blotting?

Answer 20

Est-ce que le fragment qu’on a est codant ou non codant (est-ce qu’on est dans un espace intergénique ou dans un gène)?

Question 21

Comment savoir, à l’aide du zoo blotting, qu’on est dans une région intergénique, donc non-codante?

Answer 21

On ne voit pas beaucoup de bandes sur le gel car il s’agit d’une région peu conservée donc la sonde ne peut pas s’hybrider

Question 22

De quoi dépend la détection d’un signal positif dans un zoo blot?

Answer 22

De la similarité et conservation de séquence de la sonde (concept de stringence)

Question 23

Que permet de la basse stringence?

Answer 23

L’appariement de molécules peu complémentaires

Question 24

Que permet la haute stringence?

Answer 24

L’appariement de molécules presque sinon totalement complémentaires

Question 25

De quels deux critères la stringence dépend-t-elle?

Answer 25

1) Sels

2) Température

Question 26

Si on veut être moins stringent, on ____ la concentration en sels

Answer 26

Augmente

Question 27

Que veut dire FISH?

Answer 27

Hybridation fluorescence in situ

Question 28

Qu’est-ce que la technique FISH a de différent par rapport aux autres techniques?

Answer 28

Alors que les autres techniques requièrent que l’ADN soit extrait des cellules, la technique FISH est utilisée pour détecter la présence d’un gène, d’une séquence d’ADN ou d’ARNm à l’intérieur de la cellule

Question 29

Comment fonctionne la technique FISH pour détecter de l’ADN?

Answer 29

La cellule est traitée pour dénaturer l’ADN chromosomique et le gène d’intérêt est couplé à un marqueur de fluorescence via une sonde

Question 30

Que permet la technique FISH lors de la détection de l’ADN?

Answer 30

De voir des réarrangements/translocations dans des régions chromosomiques (ce qui peut provoquer, par exemple, des cancers)

Question 31

Quelle étape de la technique FISH n’est pas faite pour la détection de l’ARN mais faite pour la détection de l’ADN?

Answer 31

La perméabilisation du noyau (permet de choisir si on veut détecter que les ARNm ou l’ADN)

Question 32

Comment se nomme les sondes qui n’émettent un signal fluorescent que lorsqu’elles sont hybridés à leur ADN cible?

Answer 32

Balises moléculaires (molecular beacon)

Question 33

Comment fonctionne les balises moléculaires?

Answer 33

Un oligo qui contient la balise moléculaire fait une boucle sur lui même, ce qui a pour effet d’apparier les deux extrémités de la balise, contenant un fluorophor d’un côté et un quenching group de l’autre. La réunion des deux empêche l’émission de fluorescence. Si la balise moléculaire se lie à de l’ADN, on ouvre la balise et permet l’émission de fluorescence