Cours 2 : ADN; détection, hybridation et applications Flashcards
Quel phosphate demeure dans la chaine d’ADN lorsqu’on fait un marquage radioactif?
Le phosphate alpha (1er phosphate)
À quoi servent les radioisotopes 32p et 35s?
Il servent à marquer le phosphate alpha pour rendre l’ADN radioactif durant sa biosynthèse
Pourquoi est-il plus avantageux d’utiliser le radioisotope 35s plutôt que le 32p?
Parce que sa demi-vie est plus longue et son énergie d’émission plus faible
Quelles sont les deux méthodes pour mesurer la radioactivité?
1) Le comptage à scintillation
2) L’autoradiographie
Dans quelle situation il faut utiliser le comptage à scintillation et dans quelle autre l’autoragiographie?
Comptage à scintillation = si l’échantillon est dans un liquide ou sur un morceau de papier filtre
Autoradiographie = si l’échantillon est dans un gel
Qu’est-ce que les scintillants vont émettent lors du comptage à scintillation?
Des pulses de lumières
Dans quel cas le comptage à scintillation est très utile?
Pour mesurer le taux de réplication de l’ADN dans différentes souches bactériennes
Sur quoi on peut voir les bandes d’ADN lors de l’autoradiographie?
Sur un film (buvard) qui a été posé sur le gel pour faire un transfert
Quand-est-ce que la fluorescence survient pour la détection de l’ADN?
Lorsqu’une molécule absorbe de la lumière d’une longueur d’onde particulière et émet de la lumière de plus faible énergie à une longueur d’onde plus longue
Quelle technique est plus dispendieuse et moins rapide entre la méthode de marquage aux radioisotopes ou la fluorescence?
La méthode de marquage aux radioisotopes
Vrai ou faux : Lors du marquage fluorescent, chaque nucléotide a une couleur appropriée à lui
Vrai
Quels sont les deux marqueurs moléculaires très utilisés pour marquer l’ADN?
1) La biotine
2) La digoxigénine
Comment fonctionne le marquage chimique de l’ADN avec la biotine ou la digoxigénine?
On met un linker sur l’uracile (dUTP), ce qui permet de le coupler à la biotine, qui va elle se lier à l’avidine qui va activer un X-Phos qui va se lier à l’oxygène pour produire un colorant bleu (révèle la présence d’un dUTP)
La température de dénaturation ou de fusion d’une molécule d’ADN donnée est définie comme étant la température _____
Au milieu de la courbe de dénaturation
Par quelle technique peut-on former de l’ADN hybride?
Hybridation
Qu’est-ce qu’un ADN hybride?
il s’agit de deux molécules d’ADN simple-brin apparentés qui sont mélangés ensemble dans la même solution (ils s’hybrident ensemble)
Qu’est-ce qu’un hybride imparfait?
Deux brins qui viennent de deux micro-organismes différents qui s’hybrident ensemble mais ne diffèrent que par une ou deux positions
Dans quel cas l’hybridation pourrait être utile?
Elle permet de déterminer à quel point deux molécules d’ADN sont reliées au niveau de leur séquence ou encore l’isolement d’un gène pour son clonage (isoler des fragments d’ADN du même gène mais provenant d’une autre espèce si l’homologie des molécules simple-brin est assez forte)
Comment fonctionne l’hybridation de type southern?
On prend le gel d’agarose après électrophorèse, on dénature tous les fragments d’ADN in situ donc à leur position et on prend une sonde simple brin qui va aller se coller au fragment simple brin d’intérêt par complémentarité
À quelle question répond le zoo blotting?
Est-ce que le fragment qu’on a est codant ou non codant (est-ce qu’on est dans un espace intergénique ou dans un gène)?
Comment savoir, à l’aide du zoo blotting, qu’on est dans une région intergénique, donc non-codante?
On ne voit pas beaucoup de bandes sur le gel car il s’agit d’une région peu conservée donc la sonde ne peut pas s’hybrider
De quoi dépend la détection d’un signal positif dans un zoo blot?
De la similarité et conservation de séquence de la sonde (concept de stringence)
Que permet de la basse stringence?
L’appariement de molécules peu complémentaires
Que permet la haute stringence?
L’appariement de molécules presque sinon totalement complémentaires
De quels deux critères la stringence dépend-t-elle?
1) Sels
2) Température
Si on veut être moins stringent, on ____ la concentration en sels
Augmente
Que veut dire FISH?
Hybridation fluorescence in situ
Qu’est-ce que la technique FISH a de différent par rapport aux autres techniques?
Alors que les autres techniques requièrent que l’ADN soit extrait des cellules, la technique FISH est utilisée pour détecter la présence d’un gène, d’une séquence d’ADN ou d’ARNm à l’intérieur de la cellule
Comment fonctionne la technique FISH pour détecter de l’ADN?
La cellule est traitée pour dénaturer l’ADN chromosomique et le gène d’intérêt est couplé à un marqueur de fluorescence via une sonde
Que permet la technique FISH lors de la détection de l’ADN?
De voir des réarrangements/translocations dans des régions chromosomiques (ce qui peut provoquer, par exemple, des cancers)
Quelle étape de la technique FISH n’est pas faite pour la détection de l’ARN mais faite pour la détection de l’ADN?
La perméabilisation du noyau (permet de choisir si on veut détecter que les ARNm ou l’ADN)
Comment se nomme les sondes qui n’émettent un signal fluorescent que lorsqu’elles sont hybridés à leur ADN cible?
Balises moléculaires (molecular beacon)
Comment fonctionne les balises moléculaires?
Un oligo qui contient la balise moléculaire fait une boucle sur lui même, ce qui a pour effet d’apparier les deux extrémités de la balise, contenant un fluorophor d’un côté et un quenching group de l’autre. La réunion des deux empêche l’émission de fluorescence. Si la balise moléculaire se lie à de l’ADN, on ouvre la balise et permet l’émission de fluorescence
