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Génétique 2 intra 2 > Cours 3 > Flashcards

Cours 3 Flashcards

1
Q

___% des gènes exprimés par une cellule sont spécifiques à ce type cellulaire

A

environ 10%

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1
Q

Transcriptome

A

L’ensemble des ARN transcrits d’une cellule

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2
Q

___% des gènes exprimés sont ubiquitaires

A

90$

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3
Q

Gènes ubiquitaires

A

exprimés par toutes les
cellules: parmi ceux-ci les “housekeeping genes” ou gènes de maintenance

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4
Q

ARNm abondants nbr de copies par cellule

A

chaque séquence présente à 1,000-10,000 copies par cellule
représente en général moins de 100 séquences différentes

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5
Q

ARNm moins abondants nbr de copies par cellule

A

environ 10,000 séquences différentes présentes chacune en moins de 10 copies par cellule
→ comprend plusieurs gènes housekeeping

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6
Q

Gènes housekeeping

A

impliqués dans la croissance, le cycle cellulaire, métabolisme: fonctions de base de la cellule

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7
Q

Génération de ADNc

A

Une amorce polyT génère des cDNA (ADN codant) à partir des ARN poly-adénylés (ARNm). Il est possible d’utiliser des amorces aléatoires (e.g. hexamères) pour quantifier d’autres types d’ARN qui n’ont pas de poly-A

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8
Q

PCR quantitatif

A

-amorces de PCR spécifiques à un ARNm d’intérêt
-Fluorescence mesurée à chaque
cycle de PCR.
- Un produit fluorescent
apparait après moins de cycle si le produit est abondant
- La comparison du nombre de cycles nécessaires pour avoir un produit plus abondant que le signal “background” ou bruit de fond permet d’évaluer l’abondance d’un cDNA, et donc d’un ARNm d’intérêt

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9
Q

Avantage de la PCR en temps réel

A

façon relativement peu coûteuse de mesurer l’expression d’ARN spécifiques

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10
Q

Désavantage de la PCR en temps réel

A

seulement quelques ARN peuvent être mesurés à la fois, i.e., “low-throughput”

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11
Q

PCR en temps réel

A

détecte la fluorescence dans
chaque puit au cours de la réaction

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12
Q

Analyse à haut débit du transcriptome par ARN-seq

A
  1. Purifier les ARN d’un tissu ou d’une population de cellule
  2. Reverse transcription: convertit les ARNm en ADNc
  3. Séquençage à haut débit des ADNc et alignement des séquences au génome
  4. Mesure le nombre de fois qu’un ADNc associé à un gène donné est séquencé pour quantifier son expression
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13
Q

Quelle est la méthode la plus utilisée en ce moment ?

A

L’ARN-seq

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14
Q

Gene ontology

A
  • Rends disponible rapidement des connaissances
    biologiques à propos d’un gène
  • Concepts organisés de façon hierachique
  • Permet de déterminer, pour un groupe de gène donnés (par exemple, à partir d’un profil transcriptomique) quelles fonctions moléculaires, processus biologique ou organelle est influencé par une condition
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15
Q

Un GO term est un énoncé qu’un gène:

A
  • est impliqué dans une fonction moléculaire
  • ou un processus biologique
  • ou est associé à une composante cellulaire
  • Tel que décrit dans une référence bibliographique
  • Déterminé par une méthode expérimentale (dans ce cas-ci IDA: Inferred from Direct Assay)
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16
Q

Comment est assurer la qualité des Go-terms?

A

Le tout est maintenu de façon manuelle et automatisé: curation d’une partie des données par des scientifiques est essentielle pour s’assurer de la qualité, mais aussi pour assigner certains gènes à des GO-terms précis

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17
Q

Initiation de la transcription eucaryote

A

Polymerase à ARN et protéines accessoires lient l’ADN. L’ADN est ouvert pour exposer le brin à transcrire, et l’ARN polymérase commence à synthétiser l’ARN. L’ARN polymérase II ne lie pas l’ADN seule.

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18
Q

Vrai ou faux,
L’ARN polymérase II lie l’ADN seule

A

Faux

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19
Q

Élongation de transcription eucaryote

A

La polymérase produit un ARN complémentaire au brin codant de l’ADN. Une autre polymérase peut commencer à synthétiser de l’ARN avant que la première ait terminé. Direction de la polymérisation: 5’ vers 3’. Brin matrice: 3’-5’. Brin codant: 5’-3’ (même séquence que l’ARNm)

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20
Q

Terminaison de la transcription eucaryote

A

La terminaison de la transcription se produit quand l’ARN polymérase rencontre une séquence appelée “terminateur”: perte d’affinité de la polymérase pour la matrice d’ADN et le relâchement de l’ARN.

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21
Q

Vrai ou faux,
Début de la transcription de l’ARN messager n’a pas de lien direct avec les codons qui dirigent la traduction en protéine.

A

Vrai

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22
Q

5’- ou 3’ UTR

A

Séquence en 5’ et 3’ qui ne sont pas traduites dans un ARNm

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23
Q

Les séquences ou structures formées dans les UTR peuvent influencé quoi?

A

la stabilité, traduction ou localisation d’un ARNm, souvent en liant des protéines

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24
Q

Les UTR font partis des exons ou des introns?

A

Exons, Malgré qu’ils soient non codant, ils ne sont pas enlevés lors de l’épisage

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25
Q

Vrai ou faux,
La transcription en ARN d’un gène peut débuter plusieurs kb avant le codon de départ
(ATG) et se terminer plusieurs kb après le codon stop

A

Vrai

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26
Q

De quoi dépend l’initiation de la transcription?

A

a liaison de l’ARN polymérase à la région promotrice en amont du
gène: comprend éléments de base et séquences régulatrices.

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27
Q

De quoi a besoin la RNA polymérase II pour reconnaitre le promoteur du gène

A

aidée par d’autres protéines qui s’assemblent au promoteur pour former un complexe formé de RNAPII et facteurs de transcription de base.

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28
Q

De quoi est formé le complexe de pré-initiation (PIC)

A

L’ARN pol II et facteurs de transcription de base se lient aux éléments de base du promoteur

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29
Q

Boite TATA

A

Boîte TATA souvent dans gènes régulés: expression dans types cellulaires précis ou induits par stimuli

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30
Q

Site BRE

A

Souvent présent avec boîte TATA (en amont ou aval de la boîte TATA)

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31
Q

Inr

A
  • Englobe le site d’initiation de la transcription
  • Peut fonctionner avec ou sans boîte TATA.
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32
Q

DPE

A

Peut fonctionner avec ou sans boîte TATA

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33
Q

MTE

A

Peut fonctionner avec ou sans boîte TATA.

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34
Q

Transcription start site

A

le site +1

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35
Q

Éléments de base d’un promoteur eucaryote

A
  • Boite TATA
  • Site BRE
  • Inr
  • DPE
  • MTE
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36
Q

Qu’est-ce qui permet de recruter la RNA pol II?

A

le promoteur qui contient des éléments de base liés par les facteurs de transcription de bases

37
Q

Appareil de transcription de base

A

6 facteurs + la RNAPII:
TFIIA, B, D, E, F, H

38
Q

Liaison de quel facteur facilite l’association des autres facteurs de transcriptions de base?

A

Liaison de TFIID à divers éléments de base du promoteur

39
Q

Assemblage de la machinerie de base pour l’initiation de la transcription

A
  1. TFIID se fixe à la boîte TATA, via sous-unité TBP (Tata-binding protein). TFIIA renforce la liaison de TBP à l’ADN. En absence de boîte TATA, d’autres sous-unités de TFIID (TAFs) se lient à d’autres éléments (Inr, DPE, MTE, etc…)
  2. TFIIB se fixent proche de la boîte TATA et peut interagir avec le site BRE. TFIIB favorise recrutement de RNAPII.
  3. RNAPII vient ensuite se fixer avec TFIIF. Ce dernier interagit avec TFIIB.
  4. TFIIE et TFIIH complètent la formation du complexe de préinitiation. Le recrutement de ces facteurs est facilité par TFIIF.
  5. TFIIH possède une activité kinase qui, en phosphorylant le CTD (carboxyterminal domain) de la RNA pol, permet à la polymérase de se défaire de plusieurs facteurs généraux de transcription et à la phase d’élongation de débuter. TFIIH a aussi une activité hélicase qui permet d’ouvrir (melting) l’ADN et permettre la transcription.
40
Q

Complexe de transcription de base + promoteur de base in vitro =

A

peu de transcription car peu de complexes ADN/facteurs/RNAPII formés

41
Q

Les séquences proximales

A

lient des régulateurs protéiques distincts des facteurs de transcription de base

42
Q

Séquences de type “silencers”

A

lient des répresseurs transcriptionnels: inhibent formation du PIC

43
Q

“Enhancers”

A

régions régulatrices distales qui peuvent agir à distance
(plusieurs kb) et favoriser ou inhiber l’expression. Situés en amont ou en aval du promoteur.

44
Q

régions régulatrices distales

A

qui peuvent agir à distance

45
Q

identification d’éléments
régulateurs dans les promoteurs eucaryotes

A
  • On transfecte un plasmide contenant un gène rapporteur (luciférase, qui génère de la lumière; gène de luciole) sous le contrôle d’un promoteur d’intérêt dans les cellules
  • En faisant diverses délétions et mutations dans la séquence du promoteur, on peut mesurer l’activité luciférase résultante, et ainsi identifier les séquences du promoteurs importantes pour l’expression
46
Q

Éléments régulateurs proximaux

A
  • Diverses protéines peuvent lier les éléments régulateurs proximaux
    -Présence d’un élément proximal et/ou de la protéine qui le lie, n’est pas suffisante pour prédire si ce gène sera activé/réprimé
  • Collaboration entre plusieurs facteurs est souvent essentielle
47
Q

Séquences dans ou autour des gènes exprimés en réponse à l’activité d’un facteur de transcription particulier peuvent être:

A

Proximaux au promoteur ou dans le cas des enhancers, plus distants

48
Q

Éléments contrôlant la réponse transcriptionnelle à un signal/stimulus spécifique sont reconnus par …

A

des facteurs qui coordonnent la transcription de gènes qui les contiennent

49
Q

Récepteur nucléaires classe 1

A
  • En absence ligand, récepteur est séquestré au cytoplasme
  • Liaison du ligand cause translocation du récepteur au noyau, où il active la transcription
50
Q

Récepteurs nucléaires classe 2

A
  • Récepteur est constitutivement nucléaire et lie un co-répresseur: inhibe la transcription
  • Liaison du ligand cause dissociation du co-répresseur et liaison d’un co-activateur, ce qui active la transcription
51
Q

Rôle des récepteurs nucléaires

A

Permet de moduler la transcription en réponse à un signal spécifique

52
Q

retardement sur gel d’électrophorèse ou EMSA

A
  • Utilisé pour valider les sites de liaison ou la liaison de facteurs sur un fragment d’ADN
  • Un fragment d’ADN synthétique contenant la séquence de liaison présumée est marqué avec de la radioactivité ou fluorescence
  • On incube ce fragment in vitro avec une protéine purifiée ou un extrait protéique cellulaire
  • On migre sur un gel non-dénaturant qui sépare les molécules selon leur taille puis autoradiogramme pour visualiser les protéines marquées
  • La présence de protéines recrutées sur l’ADN retarde sa migration en rendant le complexe plus massif/volumineux
53
Q

ChIP

A

Chromatin Immuno-Purification
- Crosslink
- Fragmentation chromatine
- Immunoprecipitation
-Purification des fragments d’ADN associés à un facteur d’intérêt après la fixation
- ADN analysé par qPCR ou par séquençage

54
Q

Que peut-on voir en utilisant le séquençage à haut débit?

A

on peut voir tous les sites liés par
une protéine à l’échelle du génome;

55
Q

Que peut-on voir en utilisant la qPCR?

A

permet une analyse ciblée de quelques sites d’intérêt

56
Q

Que permet ChIP?

A

Permet de quantifier le recrutement d’un facteur donné à une région d’ADN in vivo (dans la cellule)

57
Q

Enhancers

A
  • Régions d’ADN (50 à 1500 pb) liées par facteurs de
    transcription pour influencer l’initiation et formation du PIC
  • Peuvent être à de grandes distances (jusqu’à 1 Mb) d’un gène
  • Peuvent être soit en amont, à l’intérieur, ou en aval d’un gène.
    Peuvent être dans un intron du gène qu’ils régulent ou d’un
    autre gène voisin par exemple.
58
Q

Les isolateurs

A

régions d’ADN qui bloquent
l’action non désirée d’un enhancer sur un promoteur

59
Q

Pourquoi est important le complexe médiateur?

A

Pour la régulation de
l’expression génique par les éléments proximaux et distaux

60
Q

Complexe médiateur

A
  • Complexe protéiques de grande taille comprenant plusieurs sous-unités
  • Le médiateur agit comme pont entre les protéines régulatrices liées à leur site dans l’ADN et
    machinerie de transcription de base: différentes sous-unités de médiateur interagissent avec des
    facteurs de transcription spécifiques
61
Q

Mécanisme du complexe médiateur

A

Se lie au domaine carboxy-terminal (CTD) de l’ARN pol II non-phosphorylé (au promoteur) et facilite la fomation du Complexe de PréInitiation(PIC)
* Lors de l’élongation, le CTD devient hyperphosphorylé, ce qui abolit l’interaction avec le complexe médiateur

62
Q

Complexe médiateur + “activateur”

A

Les “activateurs” favorisent formation du PIC en liant médiateur dans une conformation qui favorise l’association de l’ARN pol II et facteurs de transcription de base avec le promoteur

63
Q

Complexe médiateur + “répresseurs”

A

Les “répresseurs” inhibent l’intéraction entre l’ARN pol II et promoteur: la conformation du complexe médiateur bloque formation du PIC dans ces conditions

64
Q

Qu’est-ce qui explique que les enhancers peuvent agir à grande distance “linéaire” d’un gène?

A

formation de boucles de chromatine qui rapprochent les complexes

65
Q

Vrai ou faux,
Régulateurs transcriptionnels peuvent soit renforcer l’interaction entre complex médiateur et l’ARN pol ou la diminuer.

A

Vrai

66
Q

Qu’est-ce qui peut former des boucles de chromatine

A

L’interaction entre le complexe médiateur et les facteurs de transcription/séquences régulatrices

67
Q

Que permet la formation de boucles par l’interaction entre séquences isolatrices

A

permet de restreindre l’activité d’un enhancer à un “domaine” particulier à l’intérieur de la boucle en question.

68
Q

Deux conditions pour qu’une protéine puisse agir comme activateur d’un gène

A
  • Capable i) de se fixer à l’ADN ou ii) d’interagir avec une protéine qui lie l’ADN (dans ce cas, on appelle les protéines co-activateur ou co-répresseur).
  • Capable d’interagir directement avec le PIC, médiateur ou d’autres facteurs de transcription afin de moduler la transcription
69
Q

Régions modulaires des facteurs de transcriptions

A

Fixation à l’ADN et domaine d’activation

70
Q

Comment intéragissent les TAFs ou le complexe médiateur avec les domaine d’activation de la transcription?

A

Physiquement

71
Q

TAF

A

TBP-associated factors

72
Q

Qu’est-ce qui interagit physiquement avec les domaines d’activation de la transcription?

A

Les TAFs ou le complexe médiateur

73
Q

Domaines d’activation de la transcription

A
  • domaine riche en acides aminés acides (chargés négativement)
  • domaine riche en glutamines
  • domaine riche en prolines
  • domaine riche en isoleucine
  • 9aaTAD (Nine-amino-acid transactivation domain).
74
Q

Que suggère la découverte d’un domaine d’activation dans une protéine non-caractérisée

A

un rôle dans la régulation transcriptionnelle

75
Q

Domaines/motifs protéiques de la liaison à l’ADN

A
  • Doigt de zinc
  • Hélice-tour-hélice
  • Zipper de leucine
  • Hélice-boucle-hélice
76
Q

Doigts de zinc

A
  • Coordination d’un atome de zinc. Structure secondaire prédite en forme de doigts.
  • Motifs souvent en série dans la protéine. Le contact se fait par l’intermédiaire d’hélices alpha (souvent via résidus chargées +).
  • Ces motifs n’intéragissent pas tous avec l’ADN. Certaines avec l’ARN, protéines, lipides ou petites molécules.
77
Q

Motif HTH

A
  • Une protéine HTH typique est un dimère
  • Chaque sous-unité HTH contient généralement 3 hélices
    alpha: les hélices 2 et 3 lient l’ADN
  • Ces hélices alpha se lient au sillon majeur
  • La dimérisation fait que les protéines lient deux sillons majeurs adjacents (voir en B dans la figure)
  • Les facteurs de transcription Hox impliqués dans le développement contiennent des motifs HTH
78
Q

Zipper de leucine

A
  • Séquence d’acides aminés ayant une leucine àtous les 7 résidus et formant une hélice alpha
  • Les résidus leucine interagissent avec les résidus leucines d’une autre protéine pour former un dimère (homodimère ou hétérodimère)
  • Chez les facteurs bZip (basic leucine zipper), la région adjacente aux leucines est basique (charge +), et interagit avec le sillon majeur de l’ADN
79
Q

Motif HLH

A
  • Contient deux segments hélicaux séparés (helix) par une boucle non-structurée (loop)
  • Les hélices permettent la dimérisation des facteurs la contenant
  • Une des hélices est suivie d’une région basique qui lie l’ADN
80
Q

Facteurs de transcription se fixent souvent à l’ADN sous quelle forme?

A

forme de dimère ou multimère

81
Q

Les formes de dimères ou multimère permet quoi?

A

Augmente le nombre d’éléments potentiellement reconnus par une protéine donnée: chaque monomère reconnait un « demi-site » du complexe. Diverses combinaisons reconnaissent des séquences d’ADN distinctes.

82
Q

Régulation combinatoire

A

Par exemple, l’expression pourrait se produire seulement dans les cellules qui expriment simultanément deux régulateurs transcriptionnels.

83
Q

Vrai ou faux,
La multimérisation des facteur permet à un répertoire limité de facteurs de transcription de réguler un grand nombre de gènes

A

Vrai

84
Q

Régulation des facteurs de transcription

A
  • Expression du régulateur transcriptionnel
  • Phosphorylation/ déphosphorylation du régulateur influence sa liaison à l’ADN
  • Liaison de ligand (eg, hormones), translocation au noyau
  • Liaison par un inhibiteur protéique
  • Formation de dimer actif/inactif
85
Q

Initiation de l’élongation

A
  • L’activité hélicase de la sous-unité TFIIH dénature l’ADN localement (dissociation des deux brins): débute à la position -10 environ et ouvre environ 25 paires de base d’ADN
86
Q

Cycles d’élongation “avortées”

A

relâchement de transcrits d’ARN tronqués de courte taille

87
Q

Transition entre pré-initiation (PIC) et début de la synthèse (initiation de l’élongation):

A

“promoter clearance” ou “escape” correspond à l’éloignement de l’ARN polymérase du promoteur et facteurs de transcription de base (environ 10 bases d’ARN synthétisées)

88
Q

À quel endroit l’ARN Pol II fait une pause souvent lors de l’élongation et pourquoi?

A

ARN Pol II fait ensuite souvent une pause aux positions +20 à +50, ce qui donne une autre opportunité de régulation

89
Q

Qu’est-ce qui régule les pauses/promoter clearance?

A

Des événements de phosphorylation du CTD de l’ARN pol II

90
Q

Terminaison de la transcription chez les eucaryotes

A
  • Les ARNm eucaryotes ont une queue 3’ terminale de polyA (environ 80 à 250 nucleotides)
  • La polyadénylation est liée à la terminaison de la transcription
  • Un complexe enzymatique lie le CTD de l’ARN Pol II et clive l’ARN dans le signal de polyadénylation (séquence qui se trouve dans l’ARNm)
  • L’ARN relâché est ensuite polyadénylé par un complexe enzymatique

Génétique 2 intra 2 (4 decks)

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