Cours 2 2me partie Flashcards
quelles sont les 4 méthodes d’analyse biochimique et biophysique
immunobuvardage (western blot)
immunoprécipitation
Essai kinase
Cristallographie par rayons X
comment génère-t-on un anticorps phospho-spécifique?
synthétiser le peptide de manière chimique puis phosphoryler le résidu de facon chimique. Le peptide synthétique peut ensuite être injecté dans un lapin/souris pour produire des anticorps polyclonaux/monoclonaux
qu’est ce qu’un anticorps phospho-spécifique
un anticorps qui reconnait une protéine spécifique avec un résidu spécifique phosphorylé
Quels AA peuvent être phosphorylés chez l’humain
la sérine,
la théronine
La tyrosine
en quoi consiste la première étape de l’essai kinase
On stimule des cellules en cultures pour qu’elles produisent la protéine d’intérêt
on fais ensuite une immunoprécipitation pour extraire la protéine d’intérêt
En quoi consiste la deuxième étape de l’essai kinase
on ajoute aux protéines d’intérêt de l’ATP radioactif. La kinase devrait transférer un groupement phosphase radioactif sur son substrat.
On peut ensuite mettre ces protéines sur un SDS-PAGE pour démontrer l’activité de la kinase
à quoi sert la cristallographie par rayons X
à déterminer la structure tridimensionnelle d’une protéine
pourquoi a t’on besoin de protéine extrèmement pure pour une cristallographie
toute les impuretés présentes dans le cristal vont générer une multitude d’artéfacts
quelles sont les méthodes qui permettent d’identifier des intéractions protéines-protéines
AP-MS (affinity purification-mass spectrometry
Y2H (Yeast-2 hybrid
FRET (förster Resonance energy transfer
PLA (proximity ligation assay)
BioID (proximity-dependant biotinylation identification)
quelles sont les étapes qui précède l’utilisation d’un spectromètre de masse dans la technoqieu AP-MS
Une protéines et ses intéracteurs sont isolés d’un mélange puis mis sur gel dénaturant. Les bandes du retrouvées sur le gel sont ensuite découpées et digéré pour passer les protéines séparées au spectromètre de masse
comment fonctionne la méthode Y2H
2 protéines qu’ont cherche à étudier sont attachées sur un facteur de liaison et d’activation pour la transcription du génome de levure
Si les deux protéines intéragissent ensemble, cela va rapprocher les 2 facteurs et activer la transcription d’un gène rapporteur, qu’on peut mesurer
En quoi consiste la méthode FRET
Les deux protéines qu’on cherche à étudier sont couplées à des fluorophores. Si les protéines intéragissent ensemble, les fluorophores vont être rapprochés et l’excitation du premier fluorophore va exciter le deuxième.
Une intéraction entre les protéines permet donc d’exciter les deux fluorophores
en quoi consiste la technique PLA
on envoit des AC primaires se lier aux deux protéines d’intérêt
On ajoute ensuite des AC secondaires qui ont une queue d’oligonucléotide
On ajoute ensuite une molécule d’ADN circulaire qui est complémentaire aux 2 oligonucléotides des AC secondaires. Elle pourra donc se lier à ces oligonucléotides s’ils sont assez proches l’un de l’autres
On ajoute une polymérase qui va répliquer l’ADN. Des nucléotides couplés à des fluorophores sont ajoutés pour détecter de l’ADN nouvellement synthétisé
en quoi consiste la technique BioID
on construit un plasmide avec la protéine d’intérêt couplé à la protéine Biotine ligase
La protéine d’intérêt va donc biotinyler les protéines qui se trouvent proches de la protéine d’intérêt lors de la culture
On peut ensuite isoler les protéines biotinylés avec de la streptavidine puis passer ces complexes dans un spectro de masse
quelles sont les 4 méthodes qui permettent de perturber les voies de signalisation
Le knock-out
Knock-down
Édition génomique avec CRSPR-Cas9
Outils pharmacologiques
Quel est le résultat d’un knockout constitutif
Absence complète de l’expression du gène visé
comment créer-t-on des knockout
On introduit des cellules Embryonnaires mutantes dans un embryon d’une souris ayant un autre background génétique (mutants noirs dans souris brune)
l’embryon est ensuite retiré de la deuxième souris (brune) et implanté dans une troisème souris, qui va donner naissance à des souris chimériques
On croise finalement les souris chimériques avec des wild type pour obtenir des hétérozygotes puis les hétérozygotes ensembles pour créer des homozygotes
quelle est la différence entre un knockout constitutif et conditionnel
dans le knockout conditionnel, on place des séquences loxP en amont et aval du gène qu’ont souhaite knocker. On croise ensuite ces souris avec des souris qui expriment la protéine Cre recombinase avec des promoteurs spécifiques à certains tissus.
La Cre recombinante clive les séquences loxP et ainsi retire le gène d’intérêt dans des tissus spécifiques
comment créer t’on des Knockdowns
on insère des des ARN doubles brins dans les cellules/tissus. Ces ARNdb vont être reconnu par la protéine Dicer qui clive l’ARNdb pour en faire des petits ARN interférents.
Les ARN interférents se lient au complexe RISC. Ce complexe clive les ARN qui sont homologues à l’ARN lié sur celui-ci
Est ce que les knockdowns doivent être effectués dans des animaux
non, on peut en faire en culture cellulaire
comment fonctionne la technique de mofidication CRSPR Cas9
La protéine Cas9 utilise un ARN guide pour aller cliver les séquences homologues à son ARN guide.
Les système des réparations utilisés par la cellule causent généralement des mutations
comment fonctionnent les inhibiteurs pharmacologiques
Ce sont des inhibiteurs certaines protéinse de transmission du signal
quels sont les problèmes avec l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques sur des essais
une dose trop élevée d’inhibiteur peut causer une perte de spécificité
Comment fonctionne les activateurs pharmacologiques
Ce sont des molécules qui vont aller activer directement des molécules de transmission qui devraient être au milieu de la chaine de signalisation
Quelles sont les trois méthodes de mesure des réponses cellulaires
Sondes moléculaires
Analyses transcriptomiques (puces à ADN/RNA-seq)
Analyse protéomique (Puces à anticorps/Spectrométrie de masse)
donner un exemple de sonde moléculaire et sa fonctionnalité
Le fura-2/dextran vert sont des sondes sensibles à la concentration de Ca2+ et qui peut être excité pour devenir fluorescent
Comment fonctionne la méthode de puce à ADN
On isole l’ARN de deux populations de cellules puis on en fais de l’ADN complémentaire avec des sondes fluorescentes. On fait ensuite un mélande des sondes fluorescentes puis on les hybride sur un puce à ADN
La puce est une lamelle ou ont été déposé des fragments d’ADN correspondants à différents gènes.
Comment analyse-t-on les trois couleurs qui résultent des puces à ADN
si un point apparait d’une couleur correspondant à une des populations, ce gène est préférablement exprimé dans cette population. Si la puce est la couleur résultant du mélange des deux fluorophores, ce gène est également exprimé dans les deux populations
Quelle méthode de mesure de réponse cellulaire a remplacé la puce à ADN dans les années récentes?
Le RNA seq
Comment fonctionne le RNA-seq
On isole les ARN de deux population de cellules qui ont des conditions différentes
On génere de l’ADNc à partir de l’ARN. On fragmente cet ADNc puis on y ajoute un linker pour faire du séquencer à haut débit avec cet ADNc
On peut ainsi voir quelles séquences sont exprimées dans quelles populations en mapant l’ADN séquencé au génome
Pourquoi le RNA-seq est il plus efficace que les puces à ADN
il effectue la même fonction (vérifier quels gènes sont exprimés dans des population de cellules) mais n’est au lieu de vérifier seulement la présence de certains gènes, il nous permet de comparer l’entièreté des gènes transcripts au génome de réference
Comment fonctionne les puces à Anticorps
de la même manière que la puce à ADN. au lieu d’extraire l’ARN de population cellulaires, on isole les protéines puis on marque celles-ci avec des fluorophores puis on les dépose sur une plaque couverte d’anticorps qui peuvent reconnaitre les protéines dans leur conformation naturelles ou phosphorylées
