Cours 2 2me partie Flashcards
quelles sont les 4 méthodes d’analyse biochimique et biophysique
immunobuvardage (western blot)
immunoprécipitation
Essai kinase
Cristallographie par rayons X
comment génère-t-on un anticorps phospho-spécifique?
synthétiser le peptide de manière chimique puis phosphoryler le résidu de facon chimique. Le peptide synthétique peut ensuite être injecté dans un lapin/souris pour produire des anticorps polyclonaux/monoclonaux
qu’est ce qu’un anticorps phospho-spécifique
un anticorps qui reconnait une protéine spécifique avec un résidu spécifique phosphorylé
Quels AA peuvent être phosphorylés chez l’humain
la sérine,
la théronine
La tyrosine
en quoi consiste la première étape de l’essai kinase
On stimule des cellules en cultures pour qu’elles produisent la protéine d’intérêt
on fais ensuite une immunoprécipitation pour extraire la protéine d’intérêt
En quoi consiste la deuxième étape de l’essai kinase
on ajoute aux protéines d’intérêt de l’ATP radioactif. La kinase devrait transférer un groupement phosphase radioactif sur son substrat.
On peut ensuite mettre ces protéines sur un SDS-PAGE pour démontrer l’activité de la kinase
à quoi sert la cristallographie par rayons X
à déterminer la structure tridimensionnelle d’une protéine
pourquoi a t’on besoin de protéine extrèmement pure pour une cristallographie
toute les impuretés présentes dans le cristal vont générer une multitude d’artéfacts
quelles sont les méthodes qui permettent d’identifier des intéractions protéines-protéines
AP-MS (affinity purification-mass spectrometry
Y2H (Yeast-2 hybrid
FRET (förster Resonance energy transfer
PLA (proximity ligation assay)
BioID (proximity-dependant biotinylation identification)
quelles sont les étapes qui précède l’utilisation d’un spectromètre de masse dans la technoqieu AP-MS
Une protéines et ses intéracteurs sont isolés d’un mélange puis mis sur gel dénaturant. Les bandes du retrouvées sur le gel sont ensuite découpées et digéré pour passer les protéines séparées au spectromètre de masse
comment fonctionne la méthode Y2H
2 protéines qu’ont cherche à étudier sont attachées sur un facteur de liaison et d’activation pour la transcription du génome de levure
Si les deux protéines intéragissent ensemble, cela va rapprocher les 2 facteurs et activer la transcription d’un gène rapporteur, qu’on peut mesurer
En quoi consiste la méthode FRET
Les deux protéines qu’on cherche à étudier sont couplées à des fluorophores. Si les protéines intéragissent ensemble, les fluorophores vont être rapprochés et l’excitation du premier fluorophore va exciter le deuxième.
Une intéraction entre les protéines permet donc d’exciter les deux fluorophores
en quoi consiste la technique PLA
on envoit des AC primaires se lier aux deux protéines d’intérêt
On ajoute ensuite des AC secondaires qui ont une queue d’oligonucléotide
On ajoute ensuite une molécule d’ADN circulaire qui est complémentaire aux 2 oligonucléotides des AC secondaires. Elle pourra donc se lier à ces oligonucléotides s’ils sont assez proches l’un de l’autres
On ajoute une polymérase qui va répliquer l’ADN. Des nucléotides couplés à des fluorophores sont ajoutés pour détecter de l’ADN nouvellement synthétisé
en quoi consiste la technique BioID
on construit un plasmide avec la protéine d’intérêt couplé à la protéine Biotine ligase
La protéine d’intérêt va donc biotinyler les protéines qui se trouvent proches de la protéine d’intérêt lors de la culture
On peut ensuite isoler les protéines biotinylés avec de la streptavidine puis passer ces complexes dans un spectro de masse
quelles sont les 4 méthodes qui permettent de perturber les voies de signalisation
Le knock-out
Knock-down
Édition génomique avec CRSPR-Cas9
Outils pharmacologiques
