Cours #2 Flashcards
4 méthodes de Next Génération Sequencing (NGS) où se produit l’analyse d’un grand nombre d’échantillons d’ADN physiquement adjacents dans un même instrument (AUTOMATISATION)
- Pyrosequencing
- Illumina (++ utilisé)
- Nanopore (MinION)
- PacBio
Quelle liaison se forme durant le pyrosequencage et qui relie l’ADN polymérase aux nucléotides
Les liaisons phosphodiesters
Lors du pyrosequencage, qu’est-ce qui est libéré à la fin de la réaction
Un pyrophosphate (2 P du dNTP) et un ion hydrogène (H+) du groupe hydroxyle
Lors pyrosequencage, enzyme qui effectue le lavage entre chaque nucléotide
Apyrase
Enzyme qui clive pyrophosphate et crée de l’ATP avec de l’APS
Sulfurylase
Comment est créé la lumière lors du pyrosequencage
La luciférase utilise de l’ATP et de la luciférine et émet de la lumière
Que produit la luciferine et l’ATP en réaction avec la luciferase
De l’oxyluciférine et de la lumière
Premier développement d’une technologie de séquençage automatisée
Pyrosequencage
Limitations du pyrosequencage
-Longueur des lectures de séquence (300-500nt), les fragments lus sont courts et l’assemblage se fait par chevauchement
-lent (un nucléotide à la fois)
Étapes principales de ILLUMINA
- Préparation de l’ADN
- «Bridge amplification» pour obtenir des «clusters»
- Séquençage
- Analyse bio-informatique
ILLUMINA, lors de son ajout, permet d’analyser plusieurs échantillons simultanément
Séquence index
À quoi sert P5 et P7
Fixation des fragments d’ADN sur la flow cell pour l’amplification
À quoi sert Rd2 et Rd1
Amorces utilisés pour initier séquençage des brins d’ADN fixés sur la flow cell
Qui suis-je, contiennent les oligonucléotides pour former P5 et P7
Puits
Qui suis-je, contiennent les oligonucléotides pour former P5 et P7
Puits
Groupe de copies identiques d’un fragment d’ADN, formé par bridge amplification sur la flow cell
Cluster
Rôle cluster
Augmenter le signal fluorescent généré lors de l’incorporation des nucléotides pour qu’il soit détectable par le capteur
Que se passe-t-il lorsque l’ADN polymerase ajoute un nucléotide couplé à un fluorophore
L’élongation arrête car le fluorophore bloque la synthèse pour que l’ordinateur enregistre la base
Qu’est-ce qui a été rendu possible par analyse bio-informatique
L’alignement des séquences («reads»)
Vrai ou faux, le génome est une série d’alignements
Vrai
Qu’est-ce que les Scaffolds
Alignements avec séquences de références
Vrai ou faux les reads sont plus longues que les contigs
Faux, les contigs sont plus longues que les reads
Longueur de chaque «cluster»
100-200nt
Rôle couverture (read depth)
S’assure qu’il n’y ait pas d’erreurs dans un cluster en relisant 20-30X la séquence
Si une lecture (read) comporte une erreur sur 200 nt, toutes les autres devraient …. (2)
- Être identiques entre elles
- Différentes de celle avec l’erreur
Petites ouvertures dans une membrane qui laisse seulement passer une molécule à la fois
Nanopores
Vrai ou faux, l’amplification est crucial lors du Nanopore Detectors for DNA
Faux, elle n’est pas nécessaire, puisqu’il n’y a pas de synthèse, seulement une molécule qui traverse
Technique de séquençage basée sur la mesure du courant électrique des bases de l’ADN à travers un trou
Séquençage par Nanopores
Technique de séquençage qui implique de l’ADN circulaire monocaténaire
PacBio
Lieu du tube digestif où se trouve le plus de bactéries
Le gros intestin (colon)
Séquence d’ADN encodant la petite sous-unité du ribosome procaryote
Le 16S ADNr
De quoi est composé le 16S ADNr
9 régions variables et 10 régions conservées
Région du 16S ADNr qui donne de l’information sur la composition et la représentation des phylum bactériens présents
V3-V4
Séquençage de cette molécule est utilisé pour analyser la diversité des bactéries ou des archées
16S ADNr
Région V3-V4 donne de l’information sur la … et la … des phylum bactériens présents (2)
- Composition
- Représentation
Région utilisé pour l’analyse du microbiote fongique
ITS2 ARNr
Autre approche du séquençage du 16S ADNr
Shotgun
Méthode shotgun
TOUT l’ADN purifié d’un échantillon est séquencé et donné de l’information plus précise sur la composition, les espèces et même les souches, pour l’identification de nouvelles espèces bactériennes
