Cours #1 Flashcards
À quoi sert le séquençage, nommer 4 fonctions
- Déterminer structure et la fonction d’un gène
- Détecter les polymorphismes
- Analyser les variations génétiques/réarrangements
- Prédire les produits possibles de fragments d’ADN
Système informatique qui sert à comparer une séquence inconnue avec tous les génomes connus
BLAST
Nommer 2 premières méthodes du séquençage de l’ADN
- Méthode chimique “Maxam-Gilbert”
- Méthode enzymatique “Sanger”
Principales étapes de la méthode Maxam-Gilbert
- Isoler ADN en la dégradant, puis digestion
- Marquage radioactif par dephosphorylation et phosphorylation avec 32 P
- Purifier fragment ADN radioactif sur gel de polyacrylamide (électrophorèse puis élution)
- Hydrolyse chimique spécifique pour chacun des 4 nucleotides
Méthode Maxam-Gilbert, type de modification du fragment par les réactifs chimiques à des sites spécifiques et pourquoi
Modification partielle et limitée pour déterminer la séquence. Partielle car ce ne sont pas toutes les bases qui sont modifiées par un certain réactif et limitée, car les conditions des traitements chimiques sont contrôlés pour seulement modifier certaines bases sans dégrader entièrement la molécule d’ADN
Vrai ou faux, les deux brins sont marqués lors du séquençage Maxam-Gilbert
Faux, un des brin est digéré pour avoir l’ADN marqué à un bout seulement
Lors de Maxam-Gilbert, où se passe la dephosphorylation et pourquoi
À l’extrémité 5’ Phosphate pour ensuite marquer par phosphorylation avec ATP radioactif
Réactif chimique spécifique pour cliver spécifiquement la guanine
Diméthylsulfate (DMS)
Réactif chimique spécifique pour cliver les purines
Acide formique
Réactif chimique spécifique pour cliver les pyrimidines
Hydrazine
Réactif chimique spécifique pour cliver la cytosine
Hydrazine+ NaCl
Comment sont diviser les échantillons d’ADN lors du séquençage Maxam-Gilbert
Ils sont divisés en 4 échantillons selon leur traitement avec réactif chimique (A, A-G, T-C, C)
Maxam-Gilbert, pourquoi faut-il dénaturer le brin d’ADN lors de l’électrophorèse
Il est important que le brin soit monocatenaire pour séparer les fragments d’ADN selon leur taille et d’assurer une migration uniforme et linéaire sur le gel
Conditions de dénaturation lors de l’electrophorèse de Maxam-Gilbert
Gel dénaturant: gel de polyacrylamide contenant de l’urée (8M)
Chaleur: 55-60 degré Celsius
Nommer 3 désavantages de la technique chimique de séquençage
- Haute sensibilité à la fraîcheur et pureté des réactifs
- Dangereux (radioactivité et produits toxiques et mutagènes tel que l’hydrazine)
- Permet seulement de séquencer de courts fragments (- de 300 nt après la site de marquage)
Différence entre la méthode enzymatique et chimique de séquençage
La méthode enzymatique intègre l’ADN au lieu de la dégrader
Cette méthode de séquençage repose sur l’interruption d’élongation de l’ADN polymérase lorsque l’enzyme y a ajouté un di-déoxynucleotide
Méthode enzymatique de Sanger
Quel est l’isotope radioactif utilisé lors de la technique de Sanger et pourquoi
35 S
Plus stable (plus longue demi-vie)
Signaux moins puissants mais permet une meilleure résolution
Action des ddNTPs
Provoque la terminaison de l’élongation
Les ddNTPs n’ont aucun groupe hydroxyle à leur extrémité 3’ ce qui empêche l’ajout de dNTPs
Vrai ou faux, le ddNTP est ajouté de façon aléatoire
Vrai
Type d’electrophorèse utilisé et son mécanisme lors de Sanger
Électrophorèse capillaire qui séparent fragments d’ADN selon leur taille.
En traversant capillaire, fragments passent devant un laser qui excite le nucleotide radioactif et qui est enregistré par un détecteur
Comment lit-on la séquence lors de Sanger
Avec un electrophorégramme qui produits des pics de couleurs
1 pic de couleur= 1 base spécifique
Équipement de base pour l’électrophorèse qui touche la surface du gel pour séparer les puits adjacents pour pouvoir remplir les puits sans contamination et offre une meilleure lecture
Peigne dents de requin
Avantage de l’isotope radioactif 35 S
Meilleure résolution
Vrai ou faux, la méthode de Sanger a permis de doubler les 4 tubes distincts pour offrir une meilleure spécificité des bases
Faux, la réaction se fait maintenant dans un seul tube puisque les couleurs des fluorochromes permet de distinguer de quel nucleotide il s’agit pour une chaîne dont l’élongation est interrompue
Vrai ou faux, l’électrophorèse en capillaire permet une lecture à plus grande distance et avec une plus grande résolution
Vrai
Par quoi les ddNTPs sont maintenant couplés pour éviter les éléments radioactifs
À des fluorochromes de couleurs différentes
Les derniers développements de la technique de Sanger ont permis quoi
L’automatisation du séquençage
Permet délimiter la région promoteur d’un gène et d’en caractériser les régions régulatrices
Extension d’amorce
Étapes principales de l’extension d’amorce
- Extension d’amorce marquée radioactivement complémentaire à l’ARN d’un gène + sa région d’homologie doit être proche d’ATG
- Élongation de l’amorce avec une reverse transcriptase jusqu’à ce qu’elle atteigne extrémité 5’ de l’ARNm (ARN-> ADN en utilisant amorce ADN)
3.fin de l’élongation correspond au début site d’initiation de la transcription
Est-ce qu’il pourrait être possible de séquencer un ARNm par extension d’amorce
Oui, si l’ARNm est assez abondante
