Cours #1

Question 1

À quoi sert le séquençage, nommer 4 fonctions

Answer 1

1. Déterminer structure et la fonction d’un gène
2. Détecter les polymorphismes
3. Analyser les variations génétiques/réarrangements
4. Prédire les produits possibles de fragments d’ADN

Question 2

Système informatique qui sert à comparer une séquence inconnue avec tous les génomes connus

Answer 2

BLAST

Question 3

Nommer 2 premières méthodes du séquençage de l’ADN

Answer 3

1. Méthode chimique “Maxam-Gilbert”
2. Méthode enzymatique “Sanger”

Question 4

Principales étapes de la méthode Maxam-Gilbert

Answer 4

1. Isoler ADN en la dégradant, puis digestion
2. Marquage radioactif par dephosphorylation et phosphorylation avec 32 P
3. Purifier fragment ADN radioactif sur gel de polyacrylamide (électrophorèse puis élution)
4. Hydrolyse chimique spécifique pour chacun des 4 nucleotides

Question 5

Méthode Maxam-Gilbert, type de modification du fragment par les réactifs chimiques à des sites spécifiques et pourquoi

Answer 5

Modification partielle et limitée pour déterminer la séquence. Partielle car ce ne sont pas toutes les bases qui sont modifiées par un certain réactif et limitée, car les conditions des traitements chimiques sont contrôlés pour seulement modifier certaines bases sans dégrader entièrement la molécule d’ADN

Question 6

Vrai ou faux, les deux brins sont marqués lors du séquençage Maxam-Gilbert

Answer 6

Faux, un des brin est digéré pour avoir l’ADN marqué à un bout seulement

Question 7

Lors de Maxam-Gilbert, où se passe la dephosphorylation et pourquoi

Answer 7

À l’extrémité 5’ Phosphate pour ensuite marquer par phosphorylation avec ATP radioactif

Question 8

Réactif chimique spécifique pour cliver spécifiquement la guanine

Answer 8

Diméthylsulfate (DMS)

Question 9

Réactif chimique spécifique pour cliver les purines

Answer 9

Acide formique

Question 10

Réactif chimique spécifique pour cliver les pyrimidines

Answer 10

Hydrazine

Question 11

Réactif chimique spécifique pour cliver la cytosine

Answer 11

Hydrazine+ NaCl

Question 12

Comment sont diviser les échantillons d’ADN lors du séquençage Maxam-Gilbert

Answer 12

Ils sont divisés en 4 échantillons selon leur traitement avec réactif chimique (A, A-G, T-C, C)

Question 13

Maxam-Gilbert, pourquoi faut-il dénaturer le brin d’ADN lors de l’électrophorèse

Answer 13

Il est important que le brin soit monocatenaire pour séparer les fragments d’ADN selon leur taille et d’assurer une migration uniforme et linéaire sur le gel

Question 14

Conditions de dénaturation lors de l’electrophorèse de Maxam-Gilbert

Answer 14

Gel dénaturant: gel de polyacrylamide contenant de l’urée (8M)
Chaleur: 55-60 degré Celsius

Question 15

Nommer 3 désavantages de la technique chimique de séquençage

Answer 15

1. Haute sensibilité à la fraîcheur et pureté des réactifs
2. Dangereux (radioactivité et produits toxiques et mutagènes tel que l’hydrazine)
3. Permet seulement de séquencer de courts fragments (- de 300 nt après la site de marquage)

Question 16

Différence entre la méthode enzymatique et chimique de séquençage

Answer 16

La méthode enzymatique intègre l’ADN au lieu de la dégrader

Question 17

Cette méthode de séquençage repose sur l’interruption d’élongation de l’ADN polymérase lorsque l’enzyme y a ajouté un di-déoxynucleotide

Answer 17

Méthode enzymatique de Sanger

Question 18

Quel est l’isotope radioactif utilisé lors de la technique de Sanger et pourquoi

Answer 18

35 S
Plus stable (plus longue demi-vie)
Signaux moins puissants mais permet une meilleure résolution

Question 19

Action des ddNTPs

Answer 19

Provoque la terminaison de l’élongation
Les ddNTPs n’ont aucun groupe hydroxyle à leur extrémité 3’ ce qui empêche l’ajout de dNTPs

Question 20

Vrai ou faux, le ddNTP est ajouté de façon aléatoire

Answer 20

Vrai

Question 21

Type d’electrophorèse utilisé et son mécanisme lors de Sanger

Answer 21

Électrophorèse capillaire qui séparent fragments d’ADN selon leur taille.
En traversant capillaire, fragments passent devant un laser qui excite le nucleotide radioactif et qui est enregistré par un détecteur

Question 22

Comment lit-on la séquence lors de Sanger

Answer 22

Avec un electrophorégramme qui produits des pics de couleurs
1 pic de couleur= 1 base spécifique

Question 23

Équipement de base pour l’électrophorèse qui touche la surface du gel pour séparer les puits adjacents pour pouvoir remplir les puits sans contamination et offre une meilleure lecture

Answer 23

Peigne dents de requin

Question 24

Avantage de l’isotope radioactif 35 S

Answer 24

Meilleure résolution

Question 25

Vrai ou faux, la méthode de Sanger a permis de doubler les 4 tubes distincts pour offrir une meilleure spécificité des bases

Answer 25

Faux, la réaction se fait maintenant dans un seul tube puisque les couleurs des fluorochromes permet de distinguer de quel nucleotide il s’agit pour une chaîne dont l’élongation est interrompue

Question 26

Vrai ou faux, l’électrophorèse en capillaire permet une lecture à plus grande distance et avec une plus grande résolution

Answer 26

Vrai

Question 27

Par quoi les ddNTPs sont maintenant couplés pour éviter les éléments radioactifs

Answer 27

À des fluorochromes de couleurs différentes

Question 28

Les derniers développements de la technique de Sanger ont permis quoi

Answer 28

L’automatisation du séquençage

Question 29

Permet délimiter la région promoteur d’un gène et d’en caractériser les régions régulatrices

Answer 29

Extension d’amorce

Question 30

Étapes principales de l’extension d’amorce

Answer 30

1. Extension d’amorce marquée radioactivement complémentaire à l’ARN d’un gène + sa région d’homologie doit être proche d’ATG
2. Élongation de l’amorce avec une reverse transcriptase jusqu’à ce qu’elle atteigne extrémité 5’ de l’ARNm (ARN-> ADN en utilisant amorce ADN)
   3.fin de l’élongation correspond au début site d’initiation de la transcription

Question 31

Est-ce qu’il pourrait être possible de séquencer un ARNm par extension d’amorce

Answer 31

Oui, si l’ARNm est assez abondante