Clonage moléculaire Flashcards
Définir clonage bactérien et en expliquer l’utilité.
Introduction d’ADN étrangers (inserts) dans une molécule vectrice (souvent un plasmide) afin d’en obtenir de multiples copies. But: Faire quelque chose de nouveau.
Décrire les plasmides bactériens.
- Petite molécule circulaire d’ADN db extrachromosomique
- Fournit des gènes supplémentaires non essentiels (ex: résistante à ATB, prod. exotoxines)
- réplication souvent autonome (indépendante du chromosome)
- Peut être acquis ou perdu
- qqs ou plusieurs copies/¢
- peut servir de vecteur lors du clonage moléculaire
Expliquer les caractéristiques intéressantes d’un plasmide pour son utilisation dans le clonage moléculaire.
- petit possible (+ long insert possible = -fragile)
- Pls copies/¢
- Site polyclonage (MCS)
- phénotype intéressant (au moins 2 ex: marqueurs de sélection)
- Promoteur fort (pour l’expression chez les bactéries)
Comparer conjugaison et transformation bactérienne.
Conjugaison: échange entre 2 bactéries via un pilus sexuel, peut être forcé en labo par filtration ou centrifugation.
Transformation: une bactérie accepte une molécule d’ADN du liquide extracellulaire, peut être forcé en labo en mélangeant des ¢ compétentes et une concentration d’ADN élevée sous conditions particulières (choc thermique ou électroporation). Rendement ↑
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (1ere étape)
1- Extraction d’ADN :
- Extraction du plasmide qui sert de vecteur à partir d’une culture bactérienne
- Extraction de l’ADN à insérer.
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (2e étape)
2- Digestion par des enzymes de restrictions
- Idéalement 2 enzymes à bouts cohésifs (moins imprévisible)
- Sur le plasmide, une coupure doit être faite dans un marqueur de sélection. L’autre marqueur reste intact.
- Les enzymes utilisées ne doivent pas couper
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (3e étape)
3- Ligation
- Mélange des fragments digérés et linéarisés (plasmide et insert)
- Ajout de l’ADN ligase
- Formation de plasmides recombinants (pls possibilités)
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (4e étape)
4- Transformation bactérienne
- Production de ¢ compétentes de la bactérie qui recevra le plasmide (vers fin phase expontielle…)
- Insertion de plasmide dans les cellules bactériennes (chic thermique ou électroporation)
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (5e étape)
5- Sélection des transformants
-Étalement d’un volume de suspension de bactéries transformées sur un milieu sélectif en fonction du marqueur de sélection intact.
Celles qui poussent = acceptées le plasmides
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (6e étape)
6- Sélection des transformants avec plasmides recombinants
- Les bactéries qui possèdent un plasmide recombinant exprime le gène qui est resté intact, mais pas celui dans lequel il y a eu insertion.
- Technique des patchs: cases numérotées, puis ensemencement sur deux milieu sélectifs. (repiquer et purifier avant)
Décrire les étapes principales du clonage moléculaire (7e étape)
7- Vérification de l’intégralité du plasmide recombinant
- faire pousser pls clônes dans le milieu approprié.
-Extraire le plasmide de chacun des clônes
- Digestion avec l’enzyme de restriction:
-refaire la digestion pour retrouver les
deux fragments qui ont été assemblés.
-Couper de façon asymétrique pour
produire nb et longueur de fragment
différent selon de nb et l’orientation
des inserts (GROS CALCUL LAID)
- Vérifier par électrophorèse.
Définir ADN recombinant, marqueur de sélection, cellules compétentes.
ADN recombinant: ADN (souvent plasmide) qui a reçu un insert.
Marqueur de sélection: un gène dont l’expression peut être dénotée et peut contribuer à une sélection.
¢ compétences : ¢ qui ont la capacité d’accepter un plasmide (fin phase exponentielle)
