Chp 2,1: les enzymes de restrictions Flashcards
ADN recombinante?
-molécule d’ADN crée dans un lab par combination des séquences d’ADN
protéine recombinant?
une protéine qui était crée par une ADN recombinant
Clonage d’un fragment ADN?
Ligation d’une molécule composées des acides nucléiques (insert) à un vecteur d’ADN
la fréquence de duplication d’ADN recombinant dépend de:
- le type de la cellule hôte
- le niveau d’activité de la cellule hôte
- type de promoteur sur le vecteur d’ADN
- d’autres éléments présent sur le vecteur
-force du promoteur
étapes d’un clonage de l’ADN?
1) construction du vecteur + insert
2) réplication et production de l’ADN recombinant dans les cellules hôtes (habituellement des bactéries) pour générer du matériel
3) purification et séquençage du fragment d’ADN (insert)
4) insertion de l’ADN recombinant (V+I) dans le modèle cellulaire à l’étude
5) expression de la protéine recombinante
6) analyse biochimiques et cellulaires
l’expérience de Dolly
- premier expérience succesif du clonage d’ADN
- inséré un nucleus d’une cellule somatique dans une cellule qui avait pas de nucléus
- une fois que l’embryo était développé, on l’a inséré dans un mère mouton
- crée un mouton Dolly
Pourquoi est-ce qu’on utilise souvent les ADN complémentaires d’un ARNm pour cloner un gène au lieu d’utilisé l’ADN génomique?
- on utilise le ADNc dérivée d’un mRNA parce qu’il a traversé des modifications post-trasncriptionnelle et contient pas des introns, etc.
cest quoi les 2 enzymes recombinants qu’on utilise pour le clonage
- enzymes de restrictions
-ADN ligases - ces enzymes sont naturellement présents dans des organismes
everything u know about enzymes de restrictions
- sont des endonucléases produites par des bactéries
- reconnaissent des régions à séquence spécifique (4-18pb) = also known as sites de restrictions and cuts them at these sites
- les sites de restrictions sont habituellement palindromiques
- cuts them en clivant le lien phosphodiester entre deux nucleotides générant un 3’hydroxyle et un 5’ phosphate (watch out for the prime here)
enzymes de modification?
- pour chaque enzyme de restriction, la bactérie produise aussi une enzyme de modification
- enzyme de modification protège l’ADN de la bactérie hôte du clivage
- they do this by modifying each potential site where the endonuclease activity is present (or close to it)
- enzyme de modification ajoute un groupement méthyle à une ou deux bases dans le site de restrictions (généralement)
- le groupement méthyle présent, empêche la reconnaissance de l’endonuclease pour son site de liaison
- this is so that the enzyme de restriction cuts the injected viral DNA and not the original host DNA
- but because we want the original host dna to cut so we can insert our insert, we use bacteria that’s mutant in methylases (méthylase = enzymes de modification)
4 types of enzymes de restriction and their functions
type I and type III: reconnaissent une séquence d’ADN spécifique et coupent en un endroit aléatoire (usually centaines de pb far away)
type II: most used, reconnaissant une séquence spécifique et coupent à un endroit spécifique dans le site de reconnaissance
type IIa : reconnaissent des séquences non palindromique et coupent l’extérieur du site de reconnaissance (leaves sticky ends)
type IIb: coupent à chaque extrémité du site de restriction (leaves blunt ends)
type IV: ciblent seulement les ADN methylés (at or near recognition sites)
sticky ends (extrémités collantes) vs blunt ends (extrémités franches), everything you know
- sticky ends: always complementary to the other fragments made by the same enzyme de restriction
- sticky ends will always s’apparier (pair up) to other fragments characterized by the same ends
fragments de restriction?
pieces of dna generated by the cleavage called restriction fragments.
Carte génétique
- can be established by using enzymes of restrictions
- gives order and frequency of sites of restrictions and the size of fragments produced
Quelle est la probabilité de trouver un site Sau3A (“GATC) dans une séquence d’ADN composée de 25% A, 25% de G, 25% de C et 25% de T?
(1/4 for A, G, C, T)= (1/4)^4 = 1/256
= en moyenne on rencontre un site Sau3A toutes les 256bp et que l’enzyme de restriction Sau3A va donner des fragments d’une taille moyenne de 256bp
