Chapitre 5 : Transcription (complet) Flashcards
Qu’est-ce qui explique la stabilité moindre des riboses?
Groupement 2’-OH sur ribonucléotides (riboND), qui rend l’ARN plus sensible à l’hydrolyse alcaline de la liaison phosphodiester rendant possible une cyclisation du phosphate, ce qui coupe la chaîne d’ARN.
Quel nouvel appariement de base est possible dans l’ARN?
G-U
Nommer les 3 types d’ARN principaux
1) ARN messager (ARNm)
2) ARN ribosomal (ARNr)
3) ARN de transfert (ARNt)
Comment fonctionne la transcriptase (ARN polymérase ADN-dépendante)?
Elle s’attache sur séquence d’ADN promoteur, ouvre le double brins d’ADN et synthétise l’ARN en additionnant des riboND complémentaires sur 3’-OH du brin d’ADN matrice. Au fur et à mesure que la transcriptase se déplace de 3’ vers 5’ sur matrice d’ADN, un tour se déroule devant et se réenroule derrière suite au détachement de l’ARN du brin matrice.
Schématiser la transcriptase et ses 5 sites importants d’entrée et de sortie
Quelle est sa forme?
Correction diapo 10 et 11 PDF chapitre 5
Forme de pince
Quels sont les rôles de chacun des ions métalliques du site actif
Mg2+ : déstabilise 2’-OH du dernier ND du nouveau brin d’ARN pour favoriser sa liaison phosphodiester au nouveau ND. Stabilise aussi la charge négative du pyrophosphate libéré par la formation du lien phosphodiester
Zn2+ : stabilise l’ARNm négatif sortant entre autre pour l’empêcher de former des boucles et nuire à la transcription.
Quelles sont les différences entre la(les) transcriptase(s) bactérienne(s) et procaryote(s)?
Bactéries : une seule transcriptase de 5 sous-unités
Eucaryotes : 3 transcriptases spécialisées de 10+ sous-unités chacune
Nommer 3 différences entre la transcription et la réplication qui permettent à la transcriptase de se passer d’amorce
1) La transcriptase lie très stablement le 1er ND lorsqu’elle y ajoute le 2e
2) Transcription déroule seulement une petite partie de l’ADN, ce qui fait que plus d’ADN est conservé en double brin lors de la transcription
3) Transcription implique seulement une enzyme, donc bulle active plus petite, plus stable, alors que réplication implique tout un réplisome très volumineux, donc grosse bulle active, donc moins stable
Donner 4 différences entre la transcription et la réplication
1) RiboND vs désoxyriboND
2) Transcriptase n’a ni besoin d’amorce ni d’hélicase
3) ARN synthétisé se détache de la matrice à mesure de la transcription, ADN redevient donc double brin derrière la transcriptase, ce qui permet à plusieurs transcriptases de se suivre et transcrire le même gène simultanément
4) Transcription fait 1 erreur/10 000 ND, alors que réplication fait 1 erreur/10 000 000 ND, pcq les erreurs dans les ARN sont moins importantes vu qu’ils sont temporaires.
Quelles sont les trois étapes de la transcription?
1) Initiation
2) Élongation
3) Terminaison
Vrai ou faux, corriger si faux : les nucléotides numérotés négatifs sont avant le nucléotide sur lequel s’attache la transcriptase, qui est le #+1
Faux, le ND #+1 est le premier qui est transcrit, le reste est vrai
Nommer et expliquer les trois étapes de l’initiation
1) Complexe fermé : liaison de la transcriptase au promoteur d’ADN dans les ND négatifs
2) Complexe ouvert : ouverture de l’ADN double brin sur environ 14 ND (bulle de transcription)
3) Complexe de transcription initial : les riboND initiaux, moins que 10, sont assemblés à la matrice, cela est très inefficace, pcq l’enzyme doit s’y prendre à plusieurs reprises avant d’échapper au promoteur, donc petits transcrits sont relâchés souvent
Quel est le rôle du promoteur?
Détermine la partie du gène à transcrire et, vu que la transcriptase se lie avec une orientation stricte au promoteur, quel brin sera matrice de transcription
Nommer et expliquer les trois facteurs rendant un promoteur fort et la contradiction qui en découle
Force d’un promoteur déterminée selon nombre de transcrits générés par unité de temps
1) Force de liaison du promoteur à la transcriptase
2) Vitesse d’isomérisation rapide : isomérisation fait référence au passage du complexe fermé à ouvert. Les séquences favorables à une isomérisation efficace seraient riches en A-T, pcq moins de liens H donc moins difficile à séparer.
3) Facilité du dépassement de la transcriptase : transcriptase doit dépasser le promoteur pour transcrire l’ARNm plus long que 10 ND.
La contradiction vient du fait qu’un promoteur liant fortement la transcriptase ne peut pas être dépassé par elle facilement, le compromis à faire est de faire des liaisons fortes, mais de courte durée.
En quoi consiste l’élongation?
Dépassement du promoteur par la transcriptase, donc passage du complexe de transcription initial au complexe ternaire stable. Au fur et à mesure, transcriptase ouvre le double brin d’ADN devant elle, le referme derrière elle, et synthétise l’ARN
Qu’est-ce qui met fin à la transcription?
La terminaison, qui, par opposition au promoteur, permet de décrocher la transcriptase et de larguer l’ARN nouvellement synthétisé
Chez les procaryotes, qu’est-ce qui permet la liaison transcriptase-promoteur?
La liaison de la sous-unité sigma (o) à la transcriptase
Quel est le facteur o le plus répandu chez E coli et quel est son fonctionnement?
o70. Il reconnaît les promoteurs ayant la séquence conservée en #-35 et celle en #-10.
Qu’est-ce qu’un promoteur consensus? que représente-t-il?
Le promoteur ayant le nucléotide majoritaire à chaque position. Il représente la définition du promoteur le plus fort.
Pourquoi tous les promoteurs n’ont pas la séquence consensus?
Parce qu’ils seraient alors tous de la même force, or la force du promoteur est un facteur de régulation de la transcription important.
Quels ajouts pourraient stabiliser le o70?
1) Élément UP devant région -35 qui donne un point de contact additionnel avec transcriptase, donc augmente force de liaison promoteur-transcriptase
2) Discriminateur devant région -10 qui stabilise l’enzyme sur le promoteur, donc augmente force de liaison promoteur-transcriptase.
3) Extension de la région -10 qui remplace la région -35 et facilite le dépassement du promoteur par la transcriptase.
Schématiser l’holoenzyme transcriptase
Correction diapo 21 PDF chapitre 5
Schématiser o7- et expliquer la fonction de ses 4 régions
Région 1 (o70-1) : reconnaît le discriminateur et participe à l’isomérisation
Région 2 (o70-2) : reconnaît région -10 et y ouvre le double brin (formation complexe ouvert)
Région 3 (o70-3) : reconnaît l’extension de région -10
Région 4 (o70-4) : reconnaît région -35.
Comment fonctionne le motif hélice-boucle-hélice et dans quelle région de o70 le retrouve-t-on?
Il s’agit de deux hélices-a reliées par une boucle d’a.a sure o70-4, qui lient la région -35 grâce à la liaison d’une séquence spécifique de bases du sillon majeur par l’une, et la liaison de la charpente sucre-P par l’autre.
Quels sont les 3 évènement majeurs de l’isomérisation en complexe ouvert?
1) Ouverture de l’ADN double brin entre #-11 et +3 (site actif de 14 ND)
2) Resserrement des pinces (B,B’) sur ADN double brin, ce qui le stabilise.
3) Expulsion de 070-1 du site actif, qui peut alors recevoir le brin matrice et commencer à transcrire.
Pour les procaryotes, schématiser et expliquer le fonctionnement du complexe initial de transcription
Correction diapo 27 PDF chapitre 5
Pour les procaryotes, qu’est-ce qui permet le passage du complexe de transcription initial au complexe ternaire stable?
Chaque fois que le complexe de transcription initial transcrit un petit ARN (10 ND et moins), ces ARN s’accumulent ce qui cause une tension qui pousse sur la région o entre o70-3 et 4 qui bloque la sortie des ARN naissants. Après suffisamment de poussées, la région o70-3/4 est expulsée, et des ARN plus grands que 10 ND peuvent être transcrits.
Quel est l’effet secondaire bénéfique de l’expulsion de o70-3/4?
L’affaiblissement des interactions transcriptase-promoteur, ce qui facilite le dépassement de celui-ci
Identifier deux différence entre le fonctionnement des complexes de transcription initial et ternaire stable
1) L’élongation de l’ARN peut dépasser 10 ND
2) Chaque fois qu’on déroule une paire de base devant la transcriptase, on en réenroule une derrière, ce qui n’était pas nécessaire pour le complexe de transcription initial pcq ne pouvait pas se déplacer sur l’ADN matrice.
Pour les procaryotes, nommer les deux types de corrections possibles
1) Pyrophosphorolytique : équivalent à “Ctrl-Z”, dernier ND ajouté est retiré par la reliaison de son groupe pyrophosphate détaché.
2) Hydrolytique : excision d’une séquence de quelques ND
Donner un exemple de facteurs protéiques contribuant à la correction de l’ARN et expliquer son fonctionnement
TRCF (Facteur de Couplage Transcription-Réparation), qui lie l’ADN derrière transcriptase et glisse jusqu’à l’enzyme jusqu’à entrer en collision avec elle. Cette collision provoque soit une reprise des activités ou le détachement complet de transcriptase.
TRCF peut ensuite recruter enzymes de réparation d’ADN Uvr A-B-C
Qu’est-ce qui caractérise le terminateur intrinsèque?
2 région riches en C-G et une finale de poly A.
Pour les procaryotes, expliquer le mécanisme de la terminaison intrinsèque
1) Détachement prématuré de la 2e région riche en G-C de l’ADN matrice pour former tige-boucle, parce que appariements ARN-ARN sont plus stables
2) Mise en pause de la polymérisation de l’ARNm
3) Libération de l’ARNm par rupture des derniers liens U-A faibles entre l’ARNm et l’ADN.
4) Détachement de la transcriptase
Sur le terminateur intrinsèque, pourquoi 1) des régions riches en C-G? 2) une région poly-A?
1) Permet l’appariement exceptionnel G-U, donc augmente la probabilité que les bases de l’ARN produit s’associent pour former la boucle.
2) Permet de facilement libérer l’ARN produit en rompant le lien ARN-ADN, pcq celui-ci n’est assuré que par des appariements U-A, qui sont faciles à rompre pcq slm 2 liens H.
Pour les procaryotes, schématiser l’ARN détaché par terminaison intrinsèque
Correction diapo 33 PDF chapitre 5
Qu’est-ce que le facteur Rho, que lie-t-il?
Hexamère (6 sous-unités) capable de lier la séquence rut, longues d’environ 40 ND, sur un ARN simple brin
Pour les procaryotes, expliquer le mécanisme de la terminaison Rho-dépendante
Facteur Rho lie la séquence rut après le codon STOP et se déplace le long de celle-ci jusqu’à atteindre la transcriptase. Lorsqu’il l’atteint, la collision entre les deux cause la dissociation de la transcriptase et la libération de l’ARNm
Nommer les transcriptases (ARN pol) eucaryotes et leurs rôles
ARN pol I et III : produisent les ARNr et ARNt
ARN pol II : produit les ARNm
Quel structure spécialisée sur l’ARN pol II permet la régulation de son activité?
Le domaine carboxy-terminal (CTD), qui est constitué d’un nombre variable de répétitions consécutives de l’heptapeptide “Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser” (52 répétitions chez l’humain).
Quelles sont les deux fonctions principales de CTD? quelle caractéristique du CTP permet ces fonctions?
1) Permet l’échappement au promoteur via le recrutement des protéines d’élongation
2) Impliqué dans le recrutement des facteurs de maturation des pré-ARNm.
La phosphorylation des Ser de ses heptapeptides, laquelle varie selon la phase du cycle cellulaire, qui agit comme le code des queues N des histones. Différents degrés de phosphorylation induisent le recrutement de différentes protéines spécifiques.
Qu’est-ce qu’un promoteur basal?
Le promoteur minimal nécessaire au déclenchement de la transcription in vitro
Quelles sont les 4 séquences conservées des promoteurs de l’ARN pol II et leur fonction?
1) BRE : reconnaissance de TFIIB
2) Boîte TATA : motif entre régions -25 et -35, détermination site de liaison du complexe initiateur, donc le site de début de la transcription, environ 25 ND plus loin
3) Inr : initiateur
4) DPE : promoteur en aval
Un promoteur aura typiquement 2 ou 3 de ces éléments, Inr étant le plus fréquent.
Donner 3 exemples de facteurs de transcription généraux (GTF) eucaryotes et leur rôle
TFIIA, TFIIB, TFIIC, etc. (Transcfiption Facteur (numéro ARN pol, lettre spécifique) constitués de TBP (TATA Binding Protein) et de TAF (reconnaissance Inr ou DPE)
Ils ont le même rôle que o70 bactérien, soit aider ARN pol à lier promoteur et initier transcription
TFIID est composé de…
1 TBP liant boite TATA
13 TAF liant Inr ou DPE
Pour les eucaryotes, schéatiser et expliquer les 5 étapes de l’assemblage du complexe d’initiation en nommant tous les facteurs
Correction diapos 45, 46, 47 (explications) et 49 (schéma) PDF chapitre 5
Pour les eucaryotes, quel facteur permet le passage de complexe ouvert en complexe fermé
Le TFIIH, qui a une activité hélicase couplée à l’hydrolyse d’ATP
Pour les eucaryotes, qu’est-ce qui déclenche l’élongation?
Lorsque ARN pol s’éloigne du site d’initiation par l’ouverture du complexe, une autre sous-unité de TFIIH phosphorile le CTD de l’ARN pol, ce qui dissocie tous les facteurs sauf TBP, ce qui permet le dépassement du promoteur.
Qu’est-ce que le complexe médiateur?
Énorme complexe protéique (20+ sous-unités) qui s’associe avec ARN pol II et facteurs de transcription et permet la modification des nucléosomes et le remodelage de la chromatide
Expliquer le fonctionnement du complexe médiateur si promoteur coincé dans un nucléosome
Correction diapo 51 PDF chapitre 5
Que fait le FACT, et quand intervient-il?
Enlève dimère H2A-H2B du nucléosome devant ARN pol II et le replace dans le nucléosome derrière. Cette modification permet de donner assez d’espace à ARN pol pour transcrire ADN entre les deux nucléosomes.
FACT intervient lorsque complexe médiateur est détaché par phosphorilation de CTD après dépassement du promoteur.
Schématiser et expliquer la terminaison “torpille”
Correction diapos 54 et 55 PDF chapitre 5
Comment fonctionne le clonage traditionnel?
Enzymes de restriction produisent fragments d’ADN, ligase soude ces fragments dans des plasmides et ces derniers sont insérés dans des bactéries
Quelles sont les différences entre un plasmide naturel et un modifié pour expérimentation?
Naturel : circulaire, auto-réplicateur, contient informations supplémentaires, mais non essentielles au génome
Modifié : Ne contient qu’un ORI (origine réplication), un marqueur de sélection (ex : résistance au antibio) et un site de multiclonage (permetttant insertion de fragments de restriction)
Quels sont les deux types de vecteurs et leur(s) rôle(s)?
De propagation : permettent réplication de grande quantité de vecteur dans bactérie, servent à purifier et amplifier ADN particulier
D’expression : permettent la production de protéines dans l’espèce d’intérêt grâce à leur promoteur actif qui répond à régulation génique
Qu’est-ce que la transformation d’un point de vue de clonage?
L’insertion d’un ADN recombinant (plasmide + gène introduit) dans une cellule hôte compétente
Qu’est-ce que la compétence génique?
La capacité naturelle d’une bactérie à récupérer ADN présent dans son milieu extracellulaire
Quelles deux techniques peuvent rendre une bactérie compétente?
Electroporation : chargement du milieu cellulaire pour déplacer protéines membranaires et former des pores ou passent les ADN
Choc thermique : augmentation de la température qui rend la membrane plus fluide, ce qui permet passage ADN
Comment trie-t-on les clones réussis des échecs?
Deux sélections :
1) Clones réussi ont le gène de résistance antibiotique, donc survivront sur un pétri ou les échecs mourront
2) Site d’insertion dans un gène donné, qui ne sera plus transcrit si transformation succès. Donc il manquera une protéine dont la réaction produit une molécule colorée, donc l’absence de couleur signifierait un clone réussi, par exemple.
Pourquoi le mécanisme de modification génique eucaryote n’est pas le même? Quels sont ces mécanismes?
N’ont pas de plasmides, donc incorporent ADN recombinant directement dans leur génome.
Deux méthodes :
Incorporation ectopique : ADN recombinant s’insère au hasard dans génome.
Remplacement d’un gène : ADN recombinant entouré de séquences précises qui permettent la recombinaison homologue avec une région du génome.
