Chapitre 4 : Applications moléculaires Flashcards
Définition : vecteur plasmidiques
Cellules (usually E.Coli) qui vont exprimé les protéines voulu en grande qtt à partir de l’ADN qui leur a été insérer.
Si je veut produire une protéine à grande échelle, quelles étapes dois-je suivre?
- Obtenir un clone d’ADNc qui code pour la protéine entière :
- RT-PCR
- Clonage par vecteur TA - Crée des vecteurs plasmidiques pour l’expression
- Insérer le plasmide dans les cellules hôte :
- CaCl2
- Éléctroporation
Comment purifier les protéines fait dans les cultures de E. Coli?
Modifier la région d’insert clonée pour qu’elle exprime une région étiquetée poly-his (6 à 7 his en C-terminal). Par la suite, on les isoles en les fixants à une matrice d’affinité (matrice de chélates de nickel pour séquences étiquetées poly-His) Tandis que les autres protéines bactériennes ne se fixe pas.
Les protéines isolée vont par la suite etres relaché en abaisant le pH de la colonne
Définition : transfection
L’insertion de nouveau matériel génétique dans une cellule eucaryotique
Quelles sont les 2 types de transfections?
Transfection transitoire
Transfection stable
Ces quoi la Transfection stable
Une méthode permettant d’intégrer un gène d’intérêt de façon permanente dans le génome d’une cellule hôte, grâce à des enzymes de réparation ou de recombinaison de l’ADN. Les cellules transfectées sont sélectionnées à l’aide d’un marqueur de résistance (ex. G-418) et criblées pour identifier celles exprimant durablement le gène.
Ces quoi la Transfection transitoire
Transfection transitoire : C’est une méthode permettant d’introduire un ADN dans une cellule hôte sans qu’il s’intègre dans son génome, entraînant une expression temporaire du gène d’intérêt. L’expression dure généralement quelques jours et ne nécessite pas de sélection à long terme des cellules transfectées.
Quelles sont les 2 voies de livraison eucaryotique?
Infection
Transfection
2 méthodes de livraisons par voie d’infection (Virale)
Virus à ADN :
- cible les cellules quiescentes (moins développé pour la thérapie génétique)
Virus à ARN :
- utilise les cellules d’empaquetage (méthode de choix pour le transfert de gènes dans les cellules somatiques en croissance)
2 méthodes de livraisons par voie de Transfections (Non-virale)
Chimique :
- Phosphate de calcium (cellules adhérentes)
- Cationique (DEAE-dextran, cation…)
- Liposome (wt, stealth, PEG)
Physique :
- microinjection (noyau/cytosol)
- balistique (projectile de complexes ADN/métaux)
- électroporation
Quelles sont les 2 gènes marqueurs utilisé pour l’ADN recombinant?
néo : est insérée dans le gène, confère la résistance à G418
tk : située à l’extérieur du gène cible confère la sensibilité au gancyclovir
Pourquoi on va insérer les gènes néo et tk dans les cellules contenant l’ADN recombinant?
Seules les cellules embryonnaires souches ayant subies une insertion homologue peuvent survivre en présence de G418 et de gancyclovir.
La souris KO est crée en 2 étapes. Quelles sont-elles?
Étape 1 - une construction d’ADN contenant un allèle inactivé d’un gène cible est introduit dans des cellules souches embryonnaires (embryonic stem ES)
Étape 2 - Lors de la création de souris KO, les cellules ES hétérozygotes pour le gène X sont injectées dans des embryons qui sont transférés dans une souris femelle (porteuses). Les descendants résultants contiennent des tissus dérivés des cellules ES transplantées et des cellules de l’hôte (souris chimères).
Explique la technique de tranfert Southern Blot
- Origine de la technique : Le Southern blot, inventé par E.M. Southern, permet de détecter des fragments d’ADN spécifiques au sein d’un mélange complexe en utilisant des enzymes de restriction pour cliver le génome.
- Migration des fragments : Lors d’une électrophorèse sur gel, les fragments d’ADN de longueurs similaires migrent ensemble, mais un fragment unique peut être identifié grâce à l’hybridation avec une sonde spécifique.
- Transfert sur filtre : Les fragments d’ADN sont dénaturés et transférés sur un filtre de nitrocellulose ou de nylon, qui conserve leur distribution pour un traitement ultérieur.
- Hybridation et détection : Une sonde nucléique marquée s’hybride au fragment d’intérêt sur le filtre, et sa position est révélée par autoradiographie.
Explique la technique de tranfert Northern Blot
- Objectif du Northern blot : Cette technique permet de déterminer quand et à quelle fréquence un gène est exprimé en détectant son ARN messager (ARNm) dans des échantillons, avec une application semi-quantitative.
- Préparation des ARN : Les ARN totaux sont dénaturés avec des agents comme le formaldéhyde pour briser les liaisons hydrogène et obtenir des molécules linéaires accessibles aux sondes.
- Séparation et transfert : Les ARN sont séparés par taille via électrophorèse sur gel, puis transférés sur un filtre de cellulose ou nylon pour une hybridation ultérieure.
- Hybridation et analyse : Une sonde radioactive ou fluorescente complémentaire à l’ARNm cible est utilisée pour détecter et quantifier les niveaux d’expression d’un gène, permettant des comparaisons entre différentes conditions expérimentales.
Explique la technique de tranfert Western Blot
Technique de détection de protéines spécifiques séparées par électrophorèses au moyen d’anticorps marqués.
Nous reconnaissons cette technique également sous le nom d’immunobuvardage soit: Direct ou indirect
Explique l’analyse par micropuce d’ADN
- Objectif de la micropuce d’ADN : La micropuce d’ADN permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans une seule expérience en utilisant des sondes spécifiques fixées sur une lame de verre.
- Structure de la micropuce : Les sondes sont des oligomères d’ADN simple brin (30-80 nucléotides) déposées à haute densité sur une lamelle, permettant de représenter des milliers de gènes ou l’ensemble du génome d’un organisme.
- Processus expérimental : Les ARNm ou cDNA de l’échantillon sont marqués par des fluorophores, hybridés sur la micropuce, et comparés à une référence pour évaluer les niveaux d’expression génique.
- Limites et utilisation actuelle : Bien que cette technique ait été révolutionnaire, elle est moins utilisée aujourd’hui que le séquençage de nouvelle génération (NGS) en raison de ses limitations liées aux séquences de sondes et à leur hybridation.
Explique le séquençage de nouvelle génération
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est une technologie à haut débit qui permet de lire simultanément les séquences d’ADN ou d’ARN de millions de fragments, fournissant des informations détaillées sur les génomes, les transcriptomes et les modifications épigénétiques.
Explique la technique de gel à retardement
La technique de gel à retardement (ou gel-shift) sert à étudier si une protéine se lie à un ADN ou ARN spécifique. Quand la protéine s’attache, l’ADN ou l’ARN migre plus lentement dans un gel, ce qui permet de repérer et de mesurer cette interaction.
Explique les gènes rapporteurs
- Utilité du gène rapporteur : Un gène rapporteur est utilisé pour étudier comment un promoteur est régulé par des molécules comme les facteurs de transcription ou les coactivateurs.
- Fonctionnement : Ce gène, inséré en aval du promoteur d’intérêt, exprime une protéine exogène dont le niveau d’expression reflète l’activité du promoteur.
- Caractéristique principale : L’expression du gène rapporteur, comme la luciférase, est facile à quantifier dans un lysat cellulaire après une expérience de transfection.
- Exemple expérimental : La luciférase produit de la lumière lorsqu’elle réagit avec la luciférine, et cette lumière est mesurée pour évaluer l’activité du promoteur dans différentes conditions.
Ces quoi IPTG?
Isopropylthiogalactoside
Substituant du lactose capable de induire une transcription contenant l’opéron lac
Ces quoi la Transformation?
Insertion d’un nouveau plasmide dans la cellule bactérienne par soit :
- CaCl2 (cellule compétente)
- Éléctroporation
L’ajout d’un épitope codant sur l’ADN recombinant inséré dans un vecteur est possible. Ce dernier se situe soit en N-terminal ou C-terminal du produit protéique tout dépendant de quoi?
Des domaines fonctionnels de la protéine recombinante.
Ces quoi la Transfection
L’insertion de nouveau matériel génétique dans une cellule eucaryotique
L’expression recombinante doit dans ce cas, être sous la régulation d’un promoteur adéquat d’un système eucaryotique
