Chapitre 3.1 : Polymérases et PCR

Question 1

Quelles sont les 4 ADN polymérases thermostables les plus populaire en laboratoire.

Answer 1

Taq, Pfx, Pfu, Vent

Question 2

Définition :

Taux d’erreurs (fidélité enzymatique)

Answer 2

Désigne la précision avec laquelle l’ADN polymérase réplique l’ADN, en minimisant les erreurs d’insertion des nucléotides.

Question 3

Taux d’erreur de la Taq polymérase

Answer 3

~ 1 x 10ˆ4 à 2 x 10ˆ5 erreurs/pb

Question 4

Taux d’erreur de la Pfu polymérase

Answer 4

~ 1.5 x 10ˆ6 erreurs/pb

Question 5

Taux d’erreur de la Vent polymérase

Answer 5

Entre la Taq ( 1 x 10ˆ4 à 2 x 10ˆ5 erreurs/pb) et la Pfu (~ 1.5 x 10ˆ6 erreurs/pb)

Question 6

Décrit en général ces quoi la PCR

Answer 6

La PCR est un processus qui permet de multiplier un fragment d’ADN choisi. Elle permet de le recopier in vitro un très grand nombre de fois en utilisant des ADN polymérases thermostables.

Question 7

Définition :

Monocaténaire

Answer 7

Molécule d’acide nucléique (ADN ou ARN) non appariée à une autre molécule complémentaire

En gros, adn simple brin

Question 8

Quelles sont les ingrédients d’une solution PCR

Answer 8

ADN matrice
Amorces
ADN polymérase
Nucléotides
Tampon PCR (buffer)
Magnésium (Mg²⁺)
Eau

Question 9

Quelles sont les 3 phases de la réaction PCR

Answer 9

Phase 1 (Dénaturation) : Séparation des 2 brins d’ADNde touts les ADNdb en chauffant la solution à 95˚C.

Phase 2 (Amorçage) : hybridation à 55˚C qui permet au amorces de s’associer par complémentarité aux régions du fragment d’ADN que l’on veut amplifier

Phase 3 (Polymérisation) : Réplication du fragment d’ADN à 72˚C à partir des amorces avec l’intervention de l’ADN polymérase.

Question 10

Définition :

Amplicon

Answer 10

Fragement d’ADN amplifié par PCR représentant la séquence cible d’intérêt.

Question 11

Pourquoi est-ce que une fois les brins d’ADN sont séparer, les brins complémentaire ne se s’amorce pas entre eux a nouveau au lieux de laisser des amorces se lier?

Answer 11

Statistique.
L’amorce est en excès dans le mélange, l’appariement de ce dernier est plus favorable que le brin complémentaire en compétition pour la même région. Il y a beaucoup plus de chance que une amorce se retrouve au bon endroit au bon moment que le brin complémentaire original.

Question 12

Quelles sont les produits qui constitue la solution tampon 10X de PCR?

Answer 12

Tris-Cl: 100 à 670 mM, pH: 8,3 :
- Sert à tamponner le milieu réactionnel au niveau optimal pour l’activité de la Taq polymérase

MgCl2: 150 à 300 mM :
- Interagie avec les forces négatives des chaines ADNdb

Question 13

Quelle est l’utilité du cation Mg2+ dans la PCR?

Answer 13

Intéragit avec les charges négatives des brins d’ADN, en réduisant les forces de répulsions pour permettre un hybridation stable des brins.

Plus sa concentration est haute, plus l’hybridation est facilité

Question 14

Quelle est la quantité recommander d’enzyme à untiliser lors d’une PCR?

Answer 14

2.5U/100uL

Question 15

Quelle est la formule pour calculer la température d’appariement optimale?

Answer 15

Tm = 4°C x (no. de G et C) + 2°C x (no. de A et T)

Question 16

Quelles sont les 3 application en biologie moléculaire de la PCR

Answer 16

1. Caractérisation moléculaire :
   - longueur (PM)
   - PCR nichée
   - séquençage
2. Clonage par PCR :
   - fragment chromosomique
   - fragment ARNm (ADNc)
3. Quantification moléculaire (PCR semi-quantitatif) :
   - PCR à temps réel
   - Qté absolue
   - Qté relative

Question 17

Comment déterminer la longueur du fragment amplifié lors de la PCR?

Answer 17

Avec l’éléctrophorèse. En comparant ces derniers avec la migration de fragments références de poids moléculaire.