Chapitre #3

Question 1

Quelles-sont les deux enzymes manquantes dans le grains de riz pour que la machinerie de production du Beta-carotène soit complète?

Answer 1

A) phytoène synthase de la jonquille

B) Phytoène désaturase bactérienne

Question 2

Qui suis-je?

L’introduction d’un gène étranger dans un génome d’intérêt.

Answer 2

La transgénèse

Question 3

Un étudiant de votre laboratoire vous suggère de faire une réaction PCR de 20 cycles, mais un autre étudiant qui écoutait votre conversation vous suggère plutôt de faire 35 cycles. Qu’est-ce que ceci changera?

Answer 3

Le nombre de cycles va influencer la quantité ou le nombre de fragments PCR produits. Augmenter le nombre de cycles va permettre de produire plus de fragments PCR.

Question 4

Qu’est-ce qui détermine la température choisie pour l’étape d’élongation? Est-ce que cette température
changerait si nous utilisions une autre série d’amorces ou une autre source d’ADN? Pourquoi?

Answer 4

La température d’élongation dépend du choix de notre enzyme (la polymérase qui synthétisera nos produits PCR). Peu importe l’ADN matrice et le choix des amorces, cette température restera la même si nous utilisons la même enzyme. L’ADN polymérase choisie travail à de hautes températures (autour de 78°C pour la Taq polymérase, par exemple).

Question 5

L’amorce sens de la 3e paire d’amorces fournie risque de poser problème lors d’une réaction PCR. Pourquoi? Que pourriez-vous faire pour régler ce problème?

Answer 5

La Tm est trop élevée (80°C) par rapport à l’autre amorce et par rapport à la température d’élongation. On vise à obtenir des Tm similaires pour nos deux amorces, ce qui permet de choisir une température d’hybridation (Ta) efficace pour les deux amorces.

Suggestion : diminuer la longueur de l’amorce ou diminuer le % CG (retirer des nucléotides C ou G). Ceci permettra de diminuer le nombre de liens hydrogènes.

Question 6

Est-ce que cette réaction de polymérisation en chaîne sera quantitative? Dites-moi pourquoi. Et si votre réponse est non, que faudrait-il faire pour qu’elle le soit?

Answer 6

Non, car l’ADN matrice est de l’ADN génomique, ce qui ne nous permet pas de mesurer le niveau d’expression d’un gène. De plus, nous allons atteindre le plateau dans le nombre d’amplicons produits, ce qui ne nous permet pas d’avoir une réaction quantitative.
Il faudra utiliser de l’ARNm et une rétrotranscriptase.

Question 7

Quelles sont les trois régions essentielles d’un vecteur de clonage et à quoi servent-elles?

Answer 7

1. Une origine de réplication. Influence sur le nombre de copies du vecteur produit par chaque cellule.
2. un marqueur de sélection. Ils permettent d’isoler les bactéries ayant incorporé les vecteurs.
3. un site de multiclonage (MCS) permettant l’insertion de fragments de restriction.

Question 8

Le clonage traditionnel utilise les enzymes de restriction pour permettre l’insertion du fragment d’ADN dans le plasmide.
Si vous aviez le choix, utiliseriez-vous des enzymes produisant des coupures cohésives ou franches? Pourquoi? Quel est leur avantage?

Answer 8

Les coupures cohésives permettent l’incorporation du fragment dans une direction seulement (clonage directionnel) et assurent une ligation plus efficace.

Question 9

À quoi servent les enzymes de restriction?

Answer 9

Coupee l’ADN en fragments de taille accessible pour pouvoir l’observer.

Question 10

Qu’est-ce que la PCR et à quoi sert-elle?

Answer 10

Réaction de polymérisation en chaine. Sert à produire une grande quantité de copies d’un segment d’ADN.

Question 11

Nommez les 4 étapes de la PCR.

Answer 11

1. Dénaturation (hausse de la T)
2. Hybridation (baisse de la T)
3. Élongation (T optimale pour pol)
4. Réactions en chaine (augmentation exponentielle du nb d’amplicons)

Question 12

Le nombre de produits PCR dépend de…
A) la température
B) le nombre de cycles
C) la longueur du brin d’ADN amplifié
D) nombre de molécules initiales matrices
E) quantité de réactifs (dNTP, amorces, enzymes)

Answer 12

Le nombre de produits PCR dépend de…

B) le nombre de cycles

D) nombre de molécules initiales matrices
E) quantité de réactifs (dNTP, amorces, enzymes)

Question 13

Quelles-sont les applications de la PCR? (6)

Answer 13

1. Identification de polymorphismes
2. Diagnostique d’infections
3. Diagnostique prénatal
4. Analyse de l’expression du gène
5. Mutagenèse
6. Fabrication d’une sonde

Question 14

Dans quelle technique utilise-t-on une endonucléase de restriction? D’où viennent-elles?

Answer 14

Technique pour fragmentation de l’ADN en fragments de taille accessible. Les enzymes viennent de bactéries.

Question 15

Quelles-sont les caractéristiques des sites de restriction?

Answer 15

4 à 8 nucleotides
Palindrome
Courts alors souvent présents plusieurs fois dans le génome

Question 16

De quelle longueur seront les fragments produits par une enzyme reconnaissant un site de 6 à 8 nucléotides?

Answer 16

Longs, Kb.

4 nucléotides: quelques centaines de pb.

Question 17

Quelle est la coupure la plus efficace et pourquoi?

Answer 17

Coupure cohésive. Permet le clonage directionnel. Laisse des extrémités libres simple brin compatibles.

Question 18

Par quelle enzyme se fait la ligation des coupures?

Answer 18

La ligase. Catalyse des liaisons phosphodiester.
Utilisée pour catalyser l’instertion des fragments de restriction compatibles à l’intérieur d’un vecteur: clonage traditionnel.

Question 19

On a deux options de ligases…

Answer 19

1. Utiliser la même enzyme 2 fois. La site de restriction est reproduit.
2. Utilisee deux enzymes différentes mais avec des coupures complémentaires. Le site de restriction ne sera pas reproduit.

Question 20

Électrophorèse et cartographie:

Sert à quoi?

Answer 20

Visualiser l’ADN sur gel d’agarose.

Question 21

Vrai ou faux.

La distance parcouruenpar le fragment est proportionnelle à sa taille moléculaire.

Answer 21

Faux, elle est inversement proportionnelle à sa taille moléculaire.

Question 22

Avec quel produit peut-on visualiser l’ADN sur gel?

Answer 22

Bromure d’ethidium. Il vient s’insérer entre les bases dans l’hélice et devient fluorescent à la lumière UV.

Question 23

Vrai ou faux.

L’ADN coupé par des enzymes de resteictio donne toujours les mêmes grandeur de frangments de restriction.

Answer 23

Vrai.

Question 24

Vrai ou faux.

On peut prédire le nombre de fragments qui seront obtenus et leur taille.

Answer 24

Vrai.

Question 25

Donnez deux exemples de vecteurs.

Answer 25

Plasmide bactérien ou viral

Question 26

Pour être de bons vecteurs, les plasmides doivent avoir:

Answer 26

1. Origine de réplication
2. Un marqueur de sélection (gène de résistance à un antibio)
3. Un site de multiclonage permettant l’insertion des fragments de restriction

Question 27

Comment peut-on sélectionner les bactéries qui ont incorporées les plasmides recombinés?

Answer 27

En les plaçant sur un milieu sélectif.

Question 28

Quelles-sont les deux catégories de vecteurs?

Answer 28

1. Vecteur de propagation: purifier et amplifier l’ADN particulier (réplication dans la bactérie)
2. Vecteur d’expression: promoteur actif qui répond à la régulation génique, dérive du génome de l’hôte. Production de protéines dans l’espèce d’intérêt.

Question 29

Comment peut-on faire la propagation du vecteur?

Answer 29

En introduisant l’ADN recombinant dans un cellule hôte par transformation (demande la compétence génétique de la bactérie)