Chapitre 3 Flashcards
Pourquoi on purifie les protéines
En général les protéines sont dans un mélange w menon abondantes mennon kae donc mnaamol exp sequentiels la nousal la protéine pure (precedure ahyan eza mnaaref el echentillion propriétés)
Méthodes grossières:
Change ph T ou ionique la hasab el solubilite de la protéine d’interet nshil el ma badna yehon. La protéine d’interet bt dal en solution
Modification de pH:
El solubilité hiye bas les interactions ben chaines latérales et solvant (eau- l. h et int electrostatiques) et (nonpol- int hydrophobes) bas ta yotlaalna hole el interactions mn ghayyer el charges des prot bi teghyir el ph w bas ph=pi la protéine précipite.
Salting-Out:
Bas nhott sel il va prendre mahal les h2o w il va neutraliser les protéines ces deux ha ykhalli el prot yaanlo aggregation w( +sulfate d’amonium plus soluble dans NaCl que H2O mn hitto <NaCl à conc maayane les prot precipitent.)
Bi meth sequentiels mn shil les prot (centrifugation hasab densité) wlli byotlaa ya mn kebbo ya dialyse ta nshil el sel
(+20% rahet A + centri dal B et C)
(+30% rahet B + centri dal C)
Centrifugation et Dialyse
Centrifugation: par force centrifuge (7asab cellule kemle, mito aw ribo— 500xG) ha ysir fi separation par densité bi sir eena surnageant et culot.
Dialyse: el Salting-Out naza3el activité tabaa el protéine donc ta nkaffe el purification mnaamol salting out bi enno nhot el solution bi sac semi-perméable b2alb solvant ha ykoun permeable lal petites molécules wmsh lal protéines)
Les méthodes fines:
Baad el grossières mn kammel aal fines bel aade par des chromatographies:
1- Echange d’ions
2- Tamissage moléculaire
3- Affinité
Bel aade mnaamelon par (FAST PROTEIN LIQUID CHROMATOGRAPHY- FPLC)
Chromatographie échange d’ion
E de Cations: phosphocellulose ou carboxyméthylcellulose.
E d’anions: DEAE
E de cations yaane - adhèrent aal membrane w + byo2taoo en plus ma mnestaamel ph ba2a! Mn zid NaCl ta Na+ aw Cl- yfout en compétition maa el m3al2in donc mn zid NaCl shwe shwe.
To proceed bel awal mn hot les protéines bi tampon pH ta nhadded el charge taboon donc pI<pH chargés - etc…
Tamissage moléculaire aw exclusion ou chromatographie de separation sur gel:
Henne des balles eendon des pores donc el kbar ma byeela2o byotlaoo en premier mais les plus petites molécules sont retenues par le gel et prennent plus de temps pour sortir. Donc separation selon MM. et pour la rendre plus précise mnaamol variation akbar bi hajem el pores.
Plusieurs utilisations:
1- purification des protéines
2- Désalage (msh salting out)
3- Détermination de MM
Chromatographie d’affinité:
Protéine (AG)+ Ligand (AC) se lie uniquement à la protéine d’interet les autres sont éluées.
Très précise bas eenda des limites:
1- Msh échelle kbire lal protéines el fina nestaamelon
2- Disponibilité alile lal ligands
3- Lezem nkoun eerfin structure el ligand el badna yeh which most of the times we dont have.
Méthodes d’analyse
Electrophorèse (SDS, PI, et 2d)
Analyse Western
SDS-PAGE
SDS- donc migrent vers + avec bleue de coomatie et échelle sur gel poreux sur puits selon leurs masses (masses> migrent le moin)
Focalisation isoélectrique:
Aa gel polyacrilamide men hot des proteines w 3ena gradient pH bas tousal aal pI el protéine C neutre donc ma bae tet7arrak
Électrophorèse à 2 dimensions:
FI plus SDS-PAGE
Machine eenda library (90% A 10% B)
Analyse Western
$$, mnaamol SDS mnerjaa mn zid des AC marqués par radio, lavage bi rouho el AC non couplés, film mn shouf el CI
(E chaînes lal AC L (50KD) aw l(25KD)
3 paramètres:
1- Activité Spécifique= Act tot/ Prot tot (U/mg)
2- Rendement= Act tot Y x100/ Act tot brute
3- Taux de purification= Act spe Y/ Act spe brute
