Chapitre 13 Flashcards
La chromatographie en phase liquide (LC)
▪ La technique de séparation analytique la plus importante actuellement.
▪ Avantages :
▪ Application à une large gamme de substances
▪ Excellente précision (≤ ±0.5%)
▪ Un large éventail d’équipements disponibles
▪ Elle est utilisée dans la plupart de laboratoires d’analyse à travers le monde
Chromatographie classique
▪ Ce type de chromatographie consiste à utiliser un cylindre de verre rempli
d’une poudre très fine (gel de silice, carbonate de calcium, oxyde
d’aluminium).
▪ L’échantillon à séparer est placé sur le dessus de la colonne et ensuite un
solvant est introduit dans la colonne.
Chromatographie classique
▪ Au fur et à mesure que le solvant s’écoule dans la colonne par gravité ou par
l’action d’une pression, les composantes de l’échantillon se déplacent à des
vitesses différentes et commencent à se séparer.
▪ Avec de la silice plus fine et une pression faible, on la nomme chromatographie éclair
Vrai ou faux: ▪ Les fractions du solvant sortant de la colonne et qui contiennent les
substances séparées sont recueillies.
▪ Le solvant des fractions est évaporé et les substances ainsi purifiées peuvent être
étudiées qualitativement ou quantitativement.
Vrai
Chromatogramme
- Courbe montrant la variation du signal du détecteur en
fonction du temps de la séparation chromatographique. - Dans un chromatogramme:
– Les solutés séparés et détectés sont
observés sous la forme d’un pic.
– L’aire ou la hauteur des pics sont
proportionnelles à la concentration de
chaque soluté.
– Les pics qui sortent en premier sont moins retenus que les pics
qui sortent à la fin.
HPLC est une chromatographie de…
chromatographie de partage.
Avantages de la HPLC:
- Température peu importante
- Débit constant de phase mobile dans la colonne
- Grand choix de phases mobile et stationnaire
HPLC vs chromatographie éclair
Pareil:
* Colonne remplie d’une phase stationnaire
* Phase mobile: un ou plusieurs solvants, habituellement mélangés
en faisant varier leur rapport (gradient de solvants)
Différent:
* Durée d’élution 100 à 1000 fois plus courte en HPLC (1 à 3 mL/min
en mode analytique, jusqu’à 20 mL/min en mode préparatif)
* Pression élevée (200 bars ou 3000 psi) maintenue par la pompe
Éléments du chromatographie
- Réservoir:
– Solvants filtrés et dégazés pour éliminer
toute particule et bulle
– Ajout d’un tampon (0.1 à 1% de base ou
d’acide) pour affiner les pics - Pompe
Partie la plus délicate de l’appareil. - Injecteur
À la seringue ou injecteur automatique:
boucle qui est lavée par la phase mobile qui
entraîne l’échantillon en tête de colonne
La colonne
Il existe des centaines de phases stationnaires différentes, dépendant
de l’application.
La silice est l’adsorbant de choix pour les composés organiques de
masse moléculaire inférieure à 2000. La séparation est difficile pour
des produits peu polaires, d’où l’utilisation de phases stationnaires
apolaires.
Détecteur vs Intégrateur
Détecteur
Différents types :
Absorption dans l’ultra-violet (UV)
Réfractomètre différentiel (indice de réfraction)
Fluorescence
Spectromètre de masse (LC-MS)
Intégrateur
Enregistrement du signal en fonction du temps
Intégration (calcul de la surface) des pics
L’aire est proportionnelle à la concentration du produit
Important du pH
Si éq entre HA et A- = pic plus large, temps de rétention et moins précis
Facteurs influençant la qualité de la séparation :
- Longueur de la colonne
- Diamètre de la colonne
- Nature de la phase stationnaire
- Nature de l’éluant, présence d’un tampon
- Débit de l’éluant
- Température de la colonne
Pensez à prendre ces informations en note dans votre cahier! Notez aussi
le temps de rétention de vos produits (caractéristique du produit dans les
conditions données).
Pour faire une analyse quantitative par HPLC:
1) Utilisation d’un étalon interne
Ajout d’une quantité précise d’un composé non réactif (rapport aire de
l’étalon/aire du produit doit être prédéterminé)
ou
2) Comparaison avec une courbe de calibration
Injecter des concentrations
Chromatographie en phase normale
lipophile sorte en premier
polaire sorte en dernier
