Chap 3 - Clonage moléculaire

Question 1

le clonage moléculaire est avant tout une méthode puissante et efficace pour?

Answer 1

Purifier l’ADN et purifier les gènes.

Question 2

Qu’est-ce qu’une cellule mérodiploïde?

Answer 2

Une cellule qui est diploïde pour une partie du chromosome.

Question 3

le clonage moléculaire est avant tout une méthode puissante et efficace pour?

Answer 3

Purifier l’ADN et purifier les gènes

Question 4

Qu’est-ce qu’une cellule mérodiploïde?

Answer 4

Une cellule qui est diploïde pour une partie du chromosome

Question 5

Comment peut-on répliquer de l’ADN étranger chez E coli?

Answer 5

Pour permettre le clonage moléculaire, il faut que l’ADN soit intégré AVANT de pénétrer dans la cellule dans un réplicon.

Question 6

Qu’est-ce qu’un réplicon?

Answer 6

Une unité de réplication formée par ne molécule d’ADN pouvant se répliquer de façon autonome dans une cellule.

Question 7

Le réplicon est reconnu par … chez les bactéries

Answer 7

L’origine de réplication du réplicon est reconnue par une ou des protéines cellulaires pour partir la réplication

Question 8

Les réplicons utilisé pour le clonage moléculaire (souvent l’ADN d’un plasmide) sont appelés?

Answer 8

Ils sont appelés des vecteurs de clonage

Question 9

Le réplicon est reconnu par … chez les bactéries

Answer 9

L’origine de réplication du réplicon est reconnue par une ou des protéines cellulaires pour partir la réplication.

Question 10

Qu’est-ce que le clonage moléculaire implique?

Answer 10

Il implique la formation d’un ADN recombiné à l’extérieur de la cellule.

Question 11

Quelle est l’expérience de Cohen et coll?

Answer 11

L’insertion d’un fragment ADn dans un plasmide (un gène de résistance à la kanamycine dans le plasmide pSC101 résistant à la tetracycline). Il s’agit du 1er exemple de clonage moléculaire.

Question 12

Le clonage moléculaire est avant tout une méthode puissante et efficace pour purifier des molécules ou des fragments ADN mais il est absolument impossible de?

Answer 12

Il est absolument impossible de purifier un fragment spécifique d’ADN à partir d’un mélange.

Question 13

Qu’est-ce qu’un clone moléculaire?

Answer 13

C’est un ensemble de molécules d’ADN toutes dérivées d’une seule par un processus de reproduction asexuée.

Question 14

Quels sont les 3 types de clone moléculaire?

Answer 14

Le fragment cloné (l’insertion) est un clone. La colonie est un clone microbiologique. L’ensemble de molécules du plasmide recombinant est un clone.

Question 15

La méthode de Sanger est utilisé pour séquencer …

Answer 15

Des gènes individuels (grande précision de lecture).

Question 16

Expliquez le principe du séquençage selon la méthode de Sanger.

Answer 16

Cette méthode exige de cloner les fragments à séquencer dans des vecteurs plasmidiques ou viraux. Chaque tube (4) contient des fragments de tailles variables correspondant à l’arrêt de la synthèse au site d’incorporation d’un ddNTP (nucléotides terminateurs). La séquence est déduite de la séparation sur gel des fragments de tous les tubes.

Question 17

Nommez les 4 stratégies historiques pour isoler un gène lorsque la protéine est connue.

Answer 17

(1) Cloner un plasmide ou l’ADNc à l’ARNm du gène d’intérêt et on identifie les clones par hybridation grâce à une sonde marquée ou une méthode immunologique.
(2) Cloner l’ADN génomique comportant le gène d’intérêt et on se sert de l’ADNc comme sonde.
(3) Sous-cloner chez un plasmide l’ADN génomique ou une partie
(4) Se servir des séquences clonées pour fin d’analyse ou de synthèse.

Question 18

Qu’est qu’un ADNc?

Answer 18

Un ADN bicaténaire contenant la même info qu’un ARNm, donc qui ne contient que els exons du gène correspondant.

Question 19

Qu’est-ce qu’une sonde moléculaire?

Answer 19

C’est une molécule d’ADN (rendue monocaténaire avant utilisation) ou d’ARN marquée au P32.

Question 20

Expliquez la nick translation pour marquer une sonde au P32.

Answer 20

Dans un tube, on met la molécule à marquer, la DNase, la ADN pol I et des nucléotides radioactifs. La DNase créé des cassures dans l’ADN et l’ADN pol I reforme les brins avec les nucléotides radioactifs.

Question 21

Expliquez la technique d’amorces multiples pur marquer une sonde au P32.

Answer 21

Chauffe la sonde à 100 C puis refroidissement brutal pour séparer les 2 brins. À 25 C, les amorces multiples s’hybrident avec la sonde et l’ADN pol I complète la séquence avec des nucléotides radioactifs. *On obtient 2 copies marquées de la sonde

Question 22

Expliquez l’hybridation moléculaire (de la sonde sur la séquence complémentaire) sur un support solide

Answer 22

La sonde (toujours monocaténaire) s’hybride à son ADN complémentaire lors de l’incubation sur le filtre où l’ADn a été déposé. Puis, on fait un lavage pour enlever les ADN marqués non hybridés avec l’ADn lié au filtre et on fait une autoradiographie.

Question 23

Expliquez la technique d’amorces multiples pour marquer une sonde au P32.

Answer 23

Chauffe la sonde à 100 C puis refroidissement brutal pour séparer les 2 brins. À 25 C, les amorces multiples s’hybrident avec la sonde et l’ADN pol I complète la séquence avec des nucléotides radioactifs. *On obtient 2 copies marquées de la sonde

Question 24

Expliquez l’hybridation moléculaire (de la sonde sur la séquence complémentaire) sur un support solide

Answer 24

La sonde (toujours monocaténaire) s’hybride à son ADN complémentaire lors de l’incubation sur le filtre où l’ADN a été déposé. Puis, on fait un lavage pour enlever les ADN marqués non hybridés avec l’ADN lié au filtre et on fait une autoradiographie.

Question 25

Comment cloner l’ADN dans un vecteur plasmidique?

Answer 25

Le plasmide contient une origne de réplication qui permet une réplication efficace du plasmide, un gène de résistance à un antibiotique pour sélectionner les cellules qui ont incorporés le plasmide et des sites de restrictions (multiples sites de clonages, polylinker) pour insérer le fragment d’ADN étranger.

Question 26

Comment cloner l’ADN dans un vecteur phagique?

Answer 26

Les séquences du milieu du génome (non esssentielles pour le phage) sont éliminées et remplacées par des sites de restrictions pour le clonage de l’ADNc. Les bras droit et gauche possèdent les gènes de structures permettant la réplication du vecteur

Question 27

Qu’est-ce qu’un banque de clones d’ADNc?

Answer 27

C’est un ensemble de clones qui représentent toutes les espèces d’ARNm présent dans le tissu ou la cellule d’intérêt.

Question 28

Comment isoler un gène?

Answer 28

(1) On part de la protéine pour remonter au gène -> stratégie historique
(2) On part de la position du gène sur la carte génétique pour cloner le gène et ensuite identifier la protéine -> clonage positionnel

Question 29

Quelle est la différence entre les clones d’ADNc et ceux d’ADN génomique dérivés de la même région?

Answer 29

SI un g;ene est plus transcrit qu’un autre, il a y plus d’ARNm pour ce gène et sera plus représenté dans la banque d’ADNc que celle d’ADN génomique où tous les clones sont représentés également.

Question 30

Qu’est-ce qu’un criblage?

Answer 30

C’est le processus d’essayer d’identifier parmi une banque de clones celui ou ceux qui contiennent la séquence d’intérêt à l’aide d’une sonde spécifique.

Question 31

Expliquez le croblage d’une banque avec une sonde.

Answer 31

On commence par étaler des phages sur un tapis bactérien et une fois que les plages de lyse sont visible, on pose un filtre de nitrocellulose sur la surface. Les particules virales des plages d’adsorbent sur le filtre et on le traite pour enlever les protéines et fixer l’ADN (monocaténaire). On incube le filtre avec une solution contenant la sonde (marquée de nucléotides radioactifs) pour l’hybridation. On lave de nouveau le filtre pour enlever les sondes non hybridées et on fait une autoradiographie pour connaitre l’emplacement de la sonde.

Question 32

Quelle est la différence entre clonage moléculaire et PCR?

Answer 32

Le clonage sert à isoler le gène et la PCR à analyser et identifer les mutations du gène.

Question 33

Qu’est-ce qui cractérise les ddNTP terminateurs?

Answer 33

Ils ne possèdent pas de groupement OH pour qu’un prochain nucléotide s’ajoute à la chaîne.

Question 34

Expliquez le séquençage de 2e génération.

Answer 34

Après la fragmentation de l’ADN, on lie des adapteurs aux extrémités des fragments et on obtient une matrice de polinies. Puis c’est l’extension enzymatique avec des nucléotides marqués aux colorants fluorescents et une lecture cyclique par imagerie de la matrice permet de savoir quelle base est intégrée.

Question 35

Quelle est la particularité de la plateforme Illumina? (séquençage 2e génération)

Answer 35

Les nucléotides ont des étiquettes colorés mais sont aussi des terminateurs réversibles. Uue fois l’étiquette enlevé, un autre nucléotide peut s’ajouter à la chaine.

Question 36

Pourquoi en criblant une bande d’ADNc avec une sonde radioactive on s’attend à avoir 6x plus de clones positifs qu’en criblant avec un anticorps.

Answer 36

Car, pour avoir reconnaissance avec l’anticorps, il faut que la protéine soit synthétisé comme il faut. Lorsque le fragment est intégré dans le vecteur, seule 1 orientation (sur 2) est la bonne. De plus, sur les 3 cadres de lecture possible de l’ADN, un seul permet de bien synthétiser la protéine. Donc, il y a 1 chance sur 6 que la protéine soit bien synthétisés et reconnue par l’anticorps, alors que la sonde s’hybride à l’ADNc peut importe l’orientation et le cadre de lecture.

Question 37

Que sont les polonies?

Answer 37

Ce sont le résultat d’amplification d’une seule molécule d’ADN par polymérase au sein d’une matrice. Chaque polonie comporte des milliers de molécules identiques d’ADN.

Question 38

Pourquoi en criblant une bande d’ADNc avec une sonde radioactive on s’attend à avoir 6x plus de clones positifs qu’en criblant avec un anticorps.

Answer 38

Car, pour avoir reconnaissance avec l’anticorps, il faut que la protéine soit synthétisé comme il faut. Lorsque le fragment est intégré dans le vecteur, seule 1 orientation (sur 2) est la bonne. De plus, sur les 3 cadres de lecture possible de l’ADN, un seul permet de bien synthétiser la protéine. Donc, il y a 1 chance sur 6 que la protéine soit bien synthétisés et reconnue par l’anticorps, alors que la sonde s’hybride à l’ADNc peut importe l’orientation et le cadre de lecture.

Question 39

Expliquez l’approche par clonage aléatoire (shotgun)

Answer 39

On clone l’ADN et on la fragmente de façon aléatoire. On agence les fragments par chevauchement (ceux qui se chevauchent se suivent dans le génome) et on peut séquencer les petits fragments pour avoir la séquence complète de l’ADN génomique. Fonctionne bien avec de petit génome ne possédant pas plusieurs séquences d’ADN répétitives.

Question 40

Expliquez l’approche par contig de clones

Answer 40

On l’utilise avec de grands génomes possédant des séquences répétés d’ADN. Pour ne pas que les séquences répétés ne chevauchent le mauvais fragment et donne la mauvaise séquence, on divise le génome en plus petites parties et on applique l’apporche shotgun sur chacune des parties.

Question 41

Dans quel contexte les méthodes de séquençage de 2e générations sont surtout utilisées?

Answer 41

Elles sont surtout utiles et utilisées pour le re-séquençage à la recherche de mutations (notamment les mutations ponctuelles).

Question 42

De nos jours, quels sont les vecteurs de clonage utilisé et pourquoi?

Answer 42

On utilise de BAC (bactérial artificial chromosomes) et de YAC (yeast artificial chromosomes) car ils peuvent accepter des insertions plus grandes.

Question 43

Quelle est l’utilité des étiquettes de séquences exprimées (EST)?

Answer 43

Elles servent à passer d’une séquence peptidique partielle à l’ADNc cloné ou amplifiée.

Question 44

Comment obtenir des EST?

Answer 44

On isole l’ARNm d’un tissu et on frabrique l’ADNc, que l’on clone pour obtenir une banque de clones. Par la suite, on pique un clone au hasard et on séquence quelques centaines de pb aux 2 extrémités. Ces séquences sont déposées dans une banque de données dbEST.

Question 45

Quelle est la différence entre une banque d’ADNc et une banque de données dbEST?

Answer 45

La banque d’ADNc est un ensemble de clones microbiologiques conservés dans des éprouvettes. La dbEST est un ensemble de séquences d’ADNc entreposées dans des ordinateurs.