BM12 - L'épissage de l'ADN

Question 1

Quel est la définition d’un exon?

Answer 1

Partie du gène non épissé.

Question 2

Vrai ou Faux: Tout les exons codent pour des protéines.

Answer 2

Faux: Il existe des exons non codants pour des protéines (ARNt, ARNr, etc.)

Question 3

Pourquoi dit-on que l’épissage des ARN pré-messagers doit être précis? En autre mots, qu’est-ce qui ne doit pas se produire durant l’épissage?

Answer 3

Il ne faut pas:

• Décaler le cadre de lecture
• Retirer un exon
• Laisser un intron

Question 4

Qu’est-ce que l’épissage alternatif? À quoi sert-il?

Answer 4

Épissage alternatif: maturation différentielle des ARN pré-messagers (exons 1,2,3,4 ou 2,4 ou 1,3,4, etc.)
Utilité: Ce mécanisme permet de produire différentes protéines (=isoformes) à partir d’un même gène.

Question 5

Vrai ou Faux: La taille des introns est très souvent supérieure à celle des exons.

Answer 5

Vrai: un intron mesure entre 0,1kb et 800kb, versus un exon qui mesure généralement 0,15kb.

Question 6

Que sont les séquences consesus des sites d’épissages 5’ et 3’?

Answer 6

GU(A/G) et AG respectivement.

Question 7

Pourquoi les sites d’épissages sont-ils dans l’intron, et non dans l’exon?

Answer 7

L’exon contient les codons nécessaires pour synthétiser la protéine, et il ne doivent pas être altérer. On ne peut donc pas modifier l’exon pour contenir des sites d’épissage.

Question 8

Quel est l’importance des exons lors de l’épissage?

Answer 8

• Il existe de l’information génétique utile au retrait des introns localisée sur les exons, au voisinage des frontières intron-exon (les AEE).
• Cette information est donc conservée et impose des contraintes la composition en acides aminés et sur le taux d’évolution des protéines.

Question 9

Vrai ou Faux: Le taux d’évolutions des amplificateurs exoniques d’épissage est 2x plus haut que le taux d’évolution des codons au centre du même exon.

Answer 9

Faux: L’inverse est vrai. Si les AEE n’étaient pas conservés, l’épissage ne serait pas possible et aucune protéine foctionnerait.

Question 10

Que sont les séquences impliqueés lors de l’épissage?

Answer 10

• Les sites d’épissages 5’ et 3’ = les séquences consensus (GU(A/G) et AG)
• Le site de branchement: adénine (A) (dans le centre de l’intron)

Question 11

Décrivez le mécanisme de l’épissage.

Answer 11

L’épissage comprends 2 réactions successives de trans-estérification.

1) Attaque nucléophile de l’hydroxyle 2’ du site de branchement (A) sur le groupe phosphate de la guanine du site donneur d’épissage 5’. Ceci mène au clivage 5’ de l’intron. Il y a aussi la formation d’un complexe à 3 branches au site de branchement.
2) Attaque nucléophile de l’hydroxyle 3’ libre de l’exon en 5’ sur le groupe phosphoryle du site accepteur d’épissage 3’. Résulte en le clivage complet entre l’intron avec lasso et l’exon 3’.

Question 12

Qu’est-ce que le lasso de l’intron?

Answer 12

Le lasso résulte de la formation d’un complexe à 3 branches au site de branchement. Les 2 hydroxyles de l’adénosine sont impliqués dans une liaison phosphodiester.

Question 13

Décrivez le bilan énergétique de l’épissage.

Answer 13

• L’énergie est conservée: 2 liaisons phosphodiester sont rompus, deux autres liaisons phosphodiester sont reformées.
• De l’énergie est cependant nécessaire pour assembler la machinerie d’épissage, l’épissosome.

Question 14

Décrivez la composition de l’épissosome. Incluez la description des 5 pnARNs dans votre réponse.

Answer 14

Épissosome: complexe ribonucléotique composé de 150 protéines et 5 petits ARNs (pnARNs)
pnARNs (U1, U2, U4, U5, U6):
-Une taille de 100 à 300 nucléotides
-Sont compléxés chacun avec quelques protéines pour former les petits ribonucléoprotéines nucléaires, les pnRNPs.

Question 15

Qu’est-ce qui assure le fonctionnement de l’activité de l’épissosome?

Answer 15

1) Les pnARNs qui vont:
-Reconnaître les séquences des sites d’épissages
-Constituer le site catalytique
Il va également y avoir des intéractions ARN-ARN (complémentarité des bases)
2) Les protéines des pnRNPs (chacun ont leur rôle), qui vont:
-Aider à reconnaître le site donneur d’épissage 5’ et reconnaître le site de branchement (A)
-Participer aux catalyses des clivages et des jonctions de l’ARN.
Il va également y avoir des intéractions ARN-protéine et protéine-protéine.

Question 16

Pourquoi la composition de l’épissosome varient-elle durant différentes étapes de la réaction d’épissage?

Answer 16

Parce que différentes protéines vont joindre ou quitter le complexe durant les différentes étapes. La substitution des différentes protéines est assurée par les motifs de reconaissance de l’ARN (MRA)

Question 17

Décrivez l’association pnARN-protéines retrouvée entre le pnARN U1 et ses protéines.

Answer 17

3 résidus conservées à l’intérieur du feuillet β permettent la reconnaissance des pnARNs, dont 1 résidu Arg(+) ou Lys (+) (intéragit avec les ponts phosphodiester et établit une liaison ionique) et 2 résidus aromatiques (s’intercalent avec les ribonucléotides).

Question 18

Que sont les rôles des pnRNPs dans l’association pnARN-protéines entre pnARN U1 et ses protéines?

Answer 18

1) Reconaissance du site d’épissage 5’ et du site de branchement
2) Rapprochement du site d’épissage 5’ avec le site de branchement
3) Aident la catalyse des réactions de clivage et de ligation de l’ARN.

Question 19

Décrivez la chronologie de l’épissage. Décrivez également la fonction de tout les complexes.

Answer 19

1) Complexe précoce (P):
- Reconaissance du site de clivage 5’ par U1
- U2AF se lie sur le site de clivage 3’ (35) puis sur le poly-pirimidine (65). U2AF65 facilite la liaison de BBP sur le site de branchement A.
2) Complexe d’extrusion de l’adénine (A):
- U2AF aide U2 à se lier au site de branchement.
- Le site de branchement A ne s’apparie pas avec U2 : l’adénine est donc extrudée et est donc disponible pour réagir avec le site de clivage 5’.
3) Complexe B (B)
- Recrutement de U5-U4-U6 (Tri-(pnRNP-pnARN)) (U4 et U6 = complémentarité des bases ARN:ARN, U5 = intéraction protéine-protéine).
- U1 va quitter le complexe B et est remplacé par U6 sur le site de clivage 5’
- Catalyse : U4 relâchée, permet à U6 d’intéragir avec U2 (ARN:ARN)
4) Complexe C: L’association U2-U6
- Rapproche le site 2’-OH (Site A) au site de clivage 5’. Ceci forme le site catalytique et facilite la première trans-esterification.
- U5 facilite la deuxième trans-esterification entre les sites 5’ et 3’ en rapprochant les 2 exons.

Question 20

Vrai ou Faux: Ce sont les protéines qui forment le site actif dans le complexe C.

Answer 20

Faux: Ce sont les pnARNs U2 et U6.

Question 21

Qu’est-ce qui garantit la spécificité du fragment à épisser dans l’épissosome?

Answer 21

La formation tardive du site catalytique de l’épissosome.

Question 22

Vrai ou Faux: Tout les introns ont besoin d’un épissosome pour être épissé.

Answer 22

Faux: Les introns du groupe I et II n’ont pas besoin d’épissosome. Ils sont auto-épissants. Cependant, ils sont très rares : la grande majorité des introns sont du type pré-ARNm nucléaire, et ont besoin d’un épissosome.

Question 23

Décrivez le fonctionnement d’un intron auto-épissant. Pourquoi les rybozymes utilisés par celui-ci ne s’ont-ils pas considérés comme de véritables enzymes?

Answer 23

• L’ARNpm de l’intron auto-épissant (400-1000nt) se replie sur lui-même pour adopter une conformation spécifique de ribozyme à l’intérieur de l’ARN précurseur, qui lui permet de catalyser sa propre excision.
• Les ribozymes codés par ces introns ne sont pas véritablement des enzymes parce qu’ils se détruisent et ne peuvent donc servir qu’une fois.

Question 24

Distinguer entre un intron de groupe I et un intron de groupe II.

Answer 24

Groupe I:
-L’intron transcrit présente une structure de poche à ribo-guanine libre. Celle-ci se fixe à l’intron 5’ et attaque le site de clivage en 5’ avec son 3’-OH libre pour former un pont phosphodiester, la coiffe G.
-Le 3’-OH libre de l’exon attaque ensuite le groupe phosphate du site d’épissage en 3’ de l’intron.
-L’intron relâché est linéaire.
Groupe II:
-Même mécanisme que pour les pré-ARNms, mais sans l’épissosome (attaque nucléophile du 2’-OH, du 3’-OH et rejet du lasso).

Question 25

Quel est la différence entre l’épissage in vitro des introns du groupe II et l’épissage in vivo des introns du groupe II?

Answer 25

In vitro: des cations (+) doivent être ajoutés pour favoriser les bons appariements nécessaire à la formation des ribozymes.
In vivo: les protéines vont jouer le rôle des cations.

Question 26

Que sont les 2 types d’erreurs possibles lors de l’épissage?

Answer 26

a) saut d’exon (un exon est épissé avec les 2 introns qui l’entoure)
b) sites d’épissages cryptiques (une partie d’un exon est épissé avec l’intron)

Question 27

Décrivez l’intéraction entre les AEE et leur protéines SR de liaison.d

Answer 27

Protéines AEE = amplificateurs exoniques d’épissages.

• Les protéines SR de liaison des AEE recrutent l’épissosome à proximité des sites de clivage 5’ et 3’. Ils recrutent spécifiquement la pnRNP U1 au site 5’ et U2AF35 au site 3’, puis U2AF65 sur le polypyrimidine. U1 et U2AF35-65 recrutent alors le restent de l’épissosome.
• Jouent également un rôle dans la régulation de l’épissage alternatif.

Question 28

Vrai ou Faux: L’action des protéines SR est spécific à leur tissu.

Answer 28

Vrai.

Question 29

Comment les protéines SR sont elles recrutées?

Answer 29

Le facteur d’élongation P-TEFb phosphoryle les sérines 2 de la queue carboxyterminale de l’ARN polymérase II, qui va recruter les protéines SR:

1) Les protéines SR sont transférées de la QCT de l’ARN polymérase II vers les AEE
2) Méthylation de H3K36 = pause de la transcription
3) Recrute alors d’autres protéines SR pour continuer l’élongation

Question 30

Comment est-ce que les protéines assurent-elles que U1 intéragit avec les facteurs de reconnaissance du site de clivage avant un site cryptique potentielle?

Answer 30

U1 est transféré sur sont site de clivage dès sa transcription. Dès que l’ARN polymérase II a terminée de transcrire le site de clivage 5’, U1 est immédiatement transféré. (IDEM pour le site 3’ et U2AF).

Question 31

Pourquoi est-il utile de produire des isoformes via l’épissage alternatif?

Answer 31

• Permets de maxisimer la diversité du protéome

- Joue un rôle essentiel dans la régulation des profils d’expression dans des différents tissus.

Question 32

Comment le corps produit-il des isoformes?

Answer 32

Des protéines de liaison à l’ARN modulent l’épissage des transcrits selon le tissu.
Exemple des protéines SR:
Selon leur concentration, les protéines SR peuvent contrôler le choix des sites d’épissage et le ratio d’inclusion/exclusion d’exons alternatifs.

Question 33

Pourquoi les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP A/B) ne peuvent-elles pas recruter l’épissosome?

Answer 33

Parce qu’elles n’ont pas de motif RS (argénine-sérine)

Question 34

Qu’est-ce qui permet de moduler l’épissage alternatif selon le type de tissu?

Answer 34

La compétition entre les ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP A/B) et les composants de l’épissosome.

Question 35

Décrivez le mécanisme d’exclusion mutuelle.

Answer 35

1) Encombrement stérique des snRNPs:
- Il faut une distance suffisante entre le site de clivage 5’ et le site de branchement A.
2) Combinaison de sites d’épissages majeurs et mineurs car aucun des épissosomes ne peut retirer un intron qui contient un site majeur et un site mineur.
3) Dégradation des codons stop précoces.

Question 36

Qu’est-ce qui distingue un site mineur d’épissage d’un site majeur d’épissage? Qu’est-ce que les deux types d’épissosomes partagent?

Answer 36

Épissosome mineur: différents snRNPs sont impliqués. Certains composants sont différents : U12 remplace U2 et U11 remplace U1. Cependant, U12 et U11 reconnaissent des différentes séquences que U2 et U1.
Similarité: La chimie de la réaction est identique entre les deux types d’épissosomes.

Question 37

Distinguez entre les protéines activatrices et les protéines inhibitrices.

Answer 37

Activatrices:
-Se lie spécifiquement aux sites appelés amplificateur intronique/exonique (AIE ou AEE) d’épissage.
-Sites activateurs: sont reconnus par les protéines SR qui s’y lient à l’ARN grâce a leur motif MRA. Le domaine RS permet le recrutement de l’épissosome.
Inhibitrices:
-Se lie spécifiquement aux sites appelés répresseurs introniques/exoniques (RIE ou REE) d’épissage.
-Site répresseurs: sont reconnus par des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Elles se lient à l’ARNm mais sont incapables de recruter l’épissosome, donc pas de motif RS.

Question 38

Vrai ou Faux: Selon plusieurs facteurs tel que leur concentration, le type cellulaire ou leur état physiologique, les protéines SR peuvent activer l’épissosome avec les sites activateur, ou même réprimer les sites d’épissages.

Answer 38

Vrai.

Question 39

Qu’est-ce que l’épissage en trans?

Answer 39

Une forme extrême d’épissage alternatif. L’adénine de l’intron du transcrit II fait une attaque nucléophile sur le phosphate en C5 de la guanine de l’intron du transcrit I. Rare chez la plupart des eucaryotes.

Question 40

Comment est-ce que des transcrits chimères dans le nucléoplasme sont-ils formés?

Answer 40

L’information génétique est transférée à l’ARN de façon colinéaire. Plusieurs gènes sont transcrits simultanément par des complexes d’ARN-Pol III.

Question 41

Pourquoi les introns ont ils été retenus/créés chez les eucaryotes?

Answer 41

Les exons sont les domaines d’une protéine. Les introns, tant qu’a eux, vont faciliter la duplication. De plus, certains exons sont partagés entre deux protéines, donc les introns permettent de les différencier.