biotecnologie Flashcards
biotecnologie
applicazioni tecnologiche che sfruttano gli esseri viventi e i loro derivati per realizzate prodotti o processi specifici
terapia genica
disattivazione di un gene o sostituzione di un gene non funzionante
- deficit dell’enzima adenosina deaminasi (ADA) → utilizzo di un vettore virale modificato per inserire il gene nelle cellule del midollo osseo
- epidermolisi bollosa giunzionale → mutazione del gene LAMB3 + trapianto di pelle geneticamente modificata
- talassemia\
clonaggio
moltiplicazione di una sequenza di DNA appartenente ad un altro genoma per mezzo di un vettore di clonaggio
- usato per creare microrganismi con lo stesso patrimonio genetico sfruttando la proprietà naturale di amplificazione del DNA per mezzo della PCR
≠ clonazione → creare organismi identici tra loro con metodi artificiali come trasferimento del nucleo, separazione degli embrioni e separazione di blastomeri
plasmide ricombinante
costituito da un DNA extracromosomico batterico in cui viene inserita una sequenza di DNA di un altro organismo → dna circolare e a doppia elica
- ha una sequenza ORI = origine di replicazione che consente al plasmide di replicarsi autonomamente
- ha un gene marcatore resistente agli antibiotici ( ampicillina )
- ha una regione polylinker → contiene sequenze riconosciute solo da specifici enzimi di restrizione => i legami mancanti sono poi terminati dalla DNA ligasi
inserimento di un plasmide
- trasformazione batterica → inglobamento con stimoli di calore o elettrici
- microiniezione negli animali
- biolistica → sparare DNA nei vegetali
endonucleasi di restrizione
enzima di restrizione che si usa per isolare uno specifico frammento di DNA e che appartengono al sistema di difesa dei batteri
- idrolizzano il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi in corrispondenza di una sequenza bersaglio
- tagliano il DNA a doppio filamento creando delle estremità appiccicose che permettono l’appaiamento tra il plasmide e il gene → sticky ends
- ogni enzima riconosce una sequenza nucleotidica specifica → l’ingegneria genetica ha portato alla sintesi di due classi endonucleasi universali = TALEN e CRISPR
elettroforesi su gel
permette di visualizzare i frammenti separati sfruttando la negatività dei gruppi fosfato, con l’aggiunta di un gel a base di agarosio → polimero i cui filamenti fungono da setaccio
agar
polisaccaride che aiuta a trasformare il terreno liquido in un gel compatto → serve per preparare il terreno per l’elettroforesi all’interno di una piastra Petri
nucleasi TALEN
si basa su fattori trascrizionali TAL → riconoscono in modo specifico le sequenze dei promotori a cui legarsi => legame avviato dall’accoppiamento tra nucleotidi e amminoacidi
- cambiando l’ordine di amminoacidi della proteina è possibile che ciascuna variante si leghi alla sequenza desiderata
- la porzione TAL guida la proteina verso una specifica sequenza → la porzione EN taglia la parte di DNA
sistema CRISPR
si basa su un naturale meccanismo di difesa dei virus → l’endonucleasi CAS9 è legata ad un RNA guida che si appaia al DNA complementare = conduce CAS9 alla zona di taglio
- sistema versatile in quanto gli RNA guida possono essere sintetizzati chimicamente => genome editing = interventi mirati per correggere un gene
clonazione
tecnica basata sul trasferimento nucleare
1. prelevamento di una cellula e aspirazione del nucleo
2. estrazione di una cellula della stessa specie maschile → viene lasciato membrana e nucleo
3. inserimento del primo nucelo nell’uovo enucleato
4. formazione di uno zigote con corredo diploide → genera un embrione che viene impiantato nell’utero di una terza pecora => nascerà un individuo identico
librerie genomiche
collezioni di cloni batterici, ciascuno contenente un diverso frammento di DNA → contengono tutti i geni espressi di una determinata cellula
- per isolare un gene si parte dall’mRNA corrispondente → attraverso un enzima trascrittasi inversa lo si converte in una copia a DNA = cDNA
- tagli di cDNA e di un vettore → estremità coesive → clonaggio e trasformazione di una cellula ospite
isolare un cDNA già inserito in un clone
sfrutta
- tendenza di due filamenti complementari ad appaiarsi spontaneamente
- capacità dell’enzima DNA polimerasi di copiare un filamento stampo → il DNA stampo è il vettore di clonaggio contenente il cDNA
=> il CNA viene estratto con la lisi delle cellule batteriche che lo contengono → viene inserito in una miscela di reazione di pcr che contiene una coppia di oligonucleotidi (primer) che forniscono l’innesco per la polimerizzazione
reazione a catena della polimerasi
amplificazione del DNA
- denaturazione → DNA riscaldato a 90° per seprare il filamento stampo
- ibridazione → temperatura abbassata a 50° per appaiamento degli oligonucleotidi
- allungamento → DNA polimerasi sintetizza la porzione di DNA stampo compresa tra i due primer
PCR per diagnosticare malattie genetiche come l’anemia falciforme
mutazione del cromosoma 11 → gene della catena β dell’emoglobina > produzione di un’emoglobina alterata
- dopo aver estratto il DNA genomico si deve analizzare solo il gene mutato → si sfrutta la PCR
- enzima di restrizione per riconoscere i frammenti di DNA contenenti la mutazione → il risultato si vede ad occhio nudo grazie ad una corsa elettroforesica su gel di agarosio
