biotecnologie Flashcards
biotecnologie
applicazioni tecnologiche che sfruttano gli esseri viventi e i loro derivati per realizzate prodotti o processi specifici
terapia genica
disattivazione di un gene o sostituzione di un gene non funzionante
- deficit dell’enzima adenosina deaminasi (ADA) → utilizzo di un vettore virale modificato per inserire il gene nelle cellule del midollo osseo
- epidermolisi bollosa giunzionale → mutazione del gene LAMB3 + trapianto di pelle geneticamente modificata
- talassemia\
clonaggio
moltiplicazione di una sequenza di DNA appartenente ad un altro genoma per mezzo di un vettore di clonaggio
- usato per creare microrganismi con lo stesso patrimonio genetico sfruttando la proprietà naturale di amplificazione del DNA per mezzo della PCR
≠ clonazione → creare organismi identici tra loro con metodi artificiali come trasferimento del nucleo, separazione degli embrioni e separazione di blastomeri
plasmide ricombinante
costituito da un DNA extracromosomico batterico in cui viene inserita una sequenza di DNA di un altro organismo → dna circolare e a doppia elica
- ha una sequenza ORI = origine di replicazione che consente al plasmide di replicarsi autonomamente
- ha un gene marcatore resistente agli antibiotici ( ampicillina )
- ha una regione polylinker → contiene sequenze riconosciute solo da specifici enzimi di restrizione => i legami mancanti sono poi terminati dalla DNA ligasi
inserimento di un plasmide
- trasformazione batterica → inglobamento con stimoli di calore o elettrici
- microiniezione negli animali
- biolistica → sparare DNA nei vegetali
endonucleasi di restrizione
enzima di restrizione che si usa per isolare uno specifico frammento di DNA e che appartengono al sistema di difesa dei batteri
- idrolizzano il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi in corrispondenza di una sequenza bersaglio
- tagliano il DNA a doppio filamento creando delle estremità appiccicose che permettono l’appaiamento tra il plasmide e il gene → sticky ends
- ogni enzima riconosce una sequenza nucleotidica specifica → l’ingegneria genetica ha portato alla sintesi di due classi endonucleasi universali = TALEN e CRISPR
elettroforesi su gel
permette di visualizzare i frammenti separati sfruttando la negatività dei gruppi fosfato, con l’aggiunta di un gel a base di agarosio → polimero i cui filamenti fungono da setaccio
agar
polisaccaride che aiuta a trasformare il terreno liquido in un gel compatto → serve per preparare il terreno per l’elettroforesi all’interno di una piastra Petri
nucleasi TALEN
si basa su fattori trascrizionali TAL → riconoscono in modo specifico le sequenze dei promotori a cui legarsi => legame avviato dall’accoppiamento tra nucleotidi e amminoacidi
- cambiando l’ordine di amminoacidi della proteina è possibile che ciascuna variante si leghi alla sequenza desiderata
- la porzione TAL guida la proteina verso una specifica sequenza → la porzione EN taglia la parte di DNA
sistema CRISPR
si basa su un naturale meccanismo di difesa dei virus → l’endonucleasi CAS9 è legata ad un RNA guida che si appaia al DNA complementare = conduce CAS9 alla zona di taglio
- sistema versatile in quanto gli RNA guida possono essere sintetizzati chimicamente => genome editing = interventi mirati per correggere un gene
clonazione
tecnica basata sul trasferimento nucleare
1. prelevamento di una cellula e aspirazione del nucleo
2. estrazione di una cellula della stessa specie maschile → viene lasciato membrana e nucleo
3. inserimento del primo nucelo nell’uovo enucleato
4. formazione di uno zigote con corredo diploide → genera un embrione che viene impiantato nell’utero di una terza pecora => nascerà un individuo identico
librerie genomiche
collezioni di cloni batterici, ciascuno contenente un diverso frammento di DNA → contengono tutti i geni espressi di una determinata cellula
- per isolare un gene si parte dall’mRNA corrispondente → attraverso un enzima trascrittasi inversa lo si converte in una copia a DNA = cDNA
- tagli di cDNA e di un vettore → estremità coesive → clonaggio e trasformazione di una cellula ospite
isolare un cDNA già inserito in un clone
sfrutta
- tendenza di due filamenti complementari ad appaiarsi spontaneamente
- capacità dell’enzima DNA polimerasi di copiare un filamento stampo → il DNA stampo è il vettore di clonaggio contenente il cDNA
=> il CNA viene estratto con la lisi delle cellule batteriche che lo contengono → viene inserito in una miscela di reazione di pcr che contiene una coppia di oligonucleotidi (primer) che forniscono l’innesco per la polimerizzazione
reazione a catena della polimerasi
amplificazione del DNA
- denaturazione → DNA riscaldato a 90° per seprare il filamento stampo
- ibridazione → temperatura abbassata a 50° per appaiamento degli oligonucleotidi
- allungamento → DNA polimerasi sintetizza la porzione di DNA stampo compresa tra i due primer
PCR per diagnosticare malattie genetiche come l’anemia falciforme
mutazione del cromosoma 11 → gene della catena β dell’emoglobina > produzione di un’emoglobina alterata
- dopo aver estratto il DNA genomico si deve analizzare solo il gene mutato → si sfrutta la PCR
- enzima di restrizione per riconoscere i frammenti di DNA contenenti la mutazione → il risultato si vede ad occhio nudo grazie ad una corsa elettroforesica su gel di agarosio
impronta genetica
- analisi dei polimorfismi dei frammenti di restrizione → se tra due individui esiste un solo nucleotide diverso, l’endonucleasi corrispondente non sarà in grado di tagliare il DNA in quel punto
- i campioni di DNA da analizzare vengono digeriti con enzimi specifici per ogni sequenza → separazione dei frammenti e visualizzarli in singole bande => i siti di taglio e le dimensioni saranno identiche se i campioni provengono dallo stesso individuo
fingerprinting
tramite la PCR si amplificano corte sequenze di DNA (STR) → corti tratti di DNA presenti in blocchi in varie parti del genoma
- si estrae del DNA genomico per avere microsatelliti → si copiano dal DNA di partenza e si isolano tramite la PCR
sequenziamento del DNA
permette di stabilire l’ordine delle basi nucleotidiche → per comprendere la funzione di un gene è necessario estrarre e decodificare l’informazione genica in esso
=> TECNICA DI SANGER
tecnica di sanger
si sfruttano i terminatori di catena = nucleotidi modificati che bloccano l’allungamento di una catena nascente [ non hanno il gruppo 3’ ossidrile necessario per creare il legame fosfodiesterico con il nucelotide successivo ]
1- il genoma viene digerito con enzimi di restrinzione
2- i frammenti di DNA sono fatti reagire con una miscela che sintetizza i filamenti complementari
3- la miscela viene divisa in quattro provette → ogni base ha una sua lunghezza diversa => in ordine crescente si ricostruisce la sequenza
vettori di espressione
permettono l’espressione di un gene clonato in un altro organismo, producendo organismi geneticamente modificati → il gene clonato può essere espresso in qualunque cellula ricevente
organismi bioreattori
molecole ad uso farmaceutico ottenute grazie a OGM → inserendo in essi un gene (che esprime una proteina) , esso viene sintetizzato dall’apparato metabolico cellulare
- insulina ricombinante 1978 → espressa in ormoni, vaccini, anticorpi
animali modello transgenici
viene modificato il genoma dei topi agouti , utili per lo studio di malattie umane → condividono il 97,5 % dei geni
- per comprendere le funzioni di singoli geni si creano topi knock-out → privi di un gene
cellule staminali
cellule non differenziate che danno origine a tessuti e cellule di un organismo
- totipotenti → embrione delle prime divisioni
- pluripotenti → embrione nella fase dei blastocisti
- multipotenti → cellule ematopoietiche tipiche di un organismo adulto
=> è possibile isolarle per avere a disposizione una riserva per differenziare diversi tipi di cellule → prodotte solo realizzando in vitro embrioni umani
iPSC
cellule staminali pluripotenti indotte ( 2012 ) → riprogrammazione di cellule adulte già differenziate => de-differenziarle la cellula riportandola ad una condizione di pluripotenza
agricoltura
- aumentare la resistenza ai parassiti → batterio del suolo Baccilus thuringiensis, possiede un gene che codifica una proteina tossica per gli insetti legandosi al loro organismo => gene cry inserito in molte specie
- piante arricchite di nutrienti → golden rice + vitamina A per il metabolismo e crescita cellulare estrayya da mais o narciso (colore giallo)
biocombustibili
bioetanolo e biodisel → sintetizzati per fermentazione di scarti di masse vegetali ricche di carboidrati, molecole complesse con struttura fibrosa
- microrganismi OGM degradano la cellulosa e sintetizzano gli acidi grassi per liberare gli zuccheri e produrre combustibile
sistema di biorisanamento
- mercurio assorbito nell’acqua → inserimento di geni merT e merP nel batterio escherichia coli, per codificare un sistema di trasporto del mercurio attraverso la membrana cellulare + metallotionina di lievito → lega il mercurio all’interno della cellula
=> i batteri vengono immobilizzati su una matrice solida creato dei biofiltri - biosensori batterici → si attivano in presenza di sostanze inquinanti grazie ad un promotore legato al GFP = gene per la proteina fluorescente che rende individuabili i batteri
