BCM TP cours 2 Flashcards
Les propriétés pour effectuer un fractionnement sont ?
Les intéractions ionique (échanges d’ions)
La taille (gel-filtration)
Spécificité (affinité)
À quoi sert une phase stationnaire ?
À ralentir les différentes substances lorsqu’ils traversent la phase.
Qu’est-ce qu’un échangeur d’ions?
Un porteur de charge qui se lie avec une protéine
L’affinité d’un échangeur avec un protéine dépend de ?
du pH de la solution : charge nette varie selon pH
nature et concentration des autres ions en solution (compétionnenent pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions)
Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de deux caractéristiques importantes:
la nature de leur matrice
le type de groupement fonctionnel utilisé
Que sont les matrices ?
Des polymères insolubles, sous forme de billes, appelés résine.
Comment est-ce que l’échangeur est grephé à la résine ?
Par lien convalant
Quelles polymères sont le plus souvent utilisés en tant que matrice :
Cellulose ou dérivé des cellulose, agarose : ils doivent être poreux pour permettre pénétration d’une protéine → rentre dans bille*
Quelles sont les deux classes d’échangeurs :
Échangeurs anioniques : portent chargent positive
Échangeurs cationiques : charge négative
Différence entre échangeur fort et faible?
échangeur fort reste pleinenement chargé entre pH 3-10
échangeur faible est chargé dans pH restreint
Comment se lient les protéines aux échangeurs ?
Par des forces électrostatiques (ionique)
Comment la protéine se lie avec l’échangeur malgré les contre-ions?
La protéine doit posséder une + grande affinité pour l’échangeur que les contre-ions, elle doit donc aussi les déplacer pour s’attacher.
Comment sont choisis le pH et la concentration saline d’une solution avec un échangeur?
Choisis de sorte que la protéine d’intérêt se trouve immobilisé sur l’échangeur d’ions. + l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée
Lavage se produit lorsque :
protéine est sur le haut de la colonne (est resté en suspension dans la solution)
Comment est lavée la solution de protéine ?
avec une solution tampon
À quoi sert l’Élution fractionnée
Protéine liés à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage
Quels sels utilisés pour l’élution ?
KCl ou NaCl
Comment fonctionne l’élution fractionnée?
Le sel déplace la protéine : les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine.
Procédé par élution par gradient
L’utilisation d’un gradient linéaire, permet de libérer une apres les autres les différentes protéine lié à l’échangeur selon leur affinité
Comment fonctionne la chromatographie par gel-filtration?
Les molécules sont séparées selon leur taille et forme
Sur quoi repose les principes de la chromatographie. par gel-filtration
1) phase stationnaire (résine) consiste à un réseau de polymère réticulé possédant des pores-> sous forme de billes
2) les pores sont grands afin de laisser les petites molécules pénétrer, mais pas toutes les protéines, ceux qui ne pénètre pas traversent rapidement la colonne
Quels sont les polymère utilisés pour le gel-filtration?
Des polymères insolubles à base de polysaccharides come le Dextrane ou l’agarose
De quoi dépend la porosité des gels ? (les pores)
- de la masse moléculaire du polymère
- du nombre de liaison croisées qui se forment entre les molécules (pontage)
Que vaut l’unité Da
1/12 de la masse de Carbone 12
Qu’est-ce que la limite d’exclusion des pores?
capacité des pores à exclure des macromolécules selon leur taille. Varie de 0.8 à 800 kDa
Par ordre, quel taille sera éliminés en premier lors du gel-filtration
Les grosse molécules qui ne pénètrent pas les pores.
Comment déterminé le volume d’élution d’une protéine
C’est le volume de solvant nécessaire e pour
éluer la protéine après son dépôt sur la colonne.
Vt = Vx + Vo
- Vx = le volume occupé par les billes
- Vo = le volume mort (volume de solvant qui entoure les billes, ~35% de Vt)
- Vt = le volume total de la colonne
À quoi sert le volume d’élution relatif d’une protéine ((Ve/Vo)?
Permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine.
Que fait la dialyse ?
Permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à des membranes semi perméables qui présentent des pores de taille inf. aux prots. (diffuse sels et petites molécules à travers membrane)
Pourquoi utilisé la dialyse ?
Utilisée pour éliminer les sels présents dans
un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après
élution avec un tampon riche en sels.
À quoi sert la Centrifugation sur colonne?
Sépare protéine selon poids moléculaire.
Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité (technique)
Un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est
fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte, protéine d’intérêt se lie au ligand immobilisé et autres prots sortent de la colonne.
Quels propriétés utilisent la Chromatographie d’affinité?
Les propriétés biochimiques uniques d’une protéine d’intérêt.
Qu’est que le Kd dans une liaison protéine-ligand?
La constance de dissociation (mesure d’affinité protéine-ligand)
Comment doit être la matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité?
- chimiquement inerte
- grande porosité
- présenter de nombreux
groupes fonctionnels capables de
former des liens covalents avec les ligand
Quel polymère est le plus utilisé en tant que matrice pour la liaison d’un ligand à une matrice?
L’agarose
Comment se fait le lien covalent entre le ligand et la matrice d’agarose?
1- réaction agarose avec bromure de cyanogène
2- ligand réagit avec agarose activé -> produit lié par covalence
*problème : protéines peuvent intérférer
*solution : bras espaceur
Que fait un bras espaceur ?
Permet à la protéine d’avoir accès au ligand.
Quelles sont les méthodes utilisées pour détecter des protéine lors de l’élution d’une colonne chromatographique?
- absorption des protéine dans l’UV (280nm)
- essai colorimétrique (produit réagit avec prots -> couleur mauve)
- essai enzymatique
- détection prots sur gel SDS-PAGE : montre degré de pureté
- détection prots avec anticorps : très spécifique
