BCM TP cours 2

Question 1

Les propriétés pour effectuer un fractionnement sont ?

Answer 1

Les intéractions ionique (échanges d’ions)

La taille (gel-filtration)

Spécificité (affinité)

Question 2

À quoi sert une phase stationnaire ?

Answer 2

À ralentir les différentes substances lorsqu’ils traversent la phase.

Question 3

Qu’est-ce qu’un échangeur d’ions?

Answer 3

Un porteur de charge qui se lie avec une protéine

Question 4

L’affinité d’un échangeur avec un protéine dépend de ?

Answer 4

du pH de la solution : charge nette varie selon pH

nature et concentration des autres ions en solution (compétionnenent pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions)

Question 5

Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de deux caractéristiques importantes:

Answer 5

la nature de leur matrice

le type de groupement fonctionnel utilisé

Question 6

Que sont les matrices ?

Answer 6

Des polymères insolubles, sous forme de billes, appelés résine.

Question 7

Comment est-ce que l’échangeur est grephé à la résine ?

Answer 7

Par lien convalant

Question 7

Quelles polymères sont le plus souvent utilisés en tant que matrice :

Answer 7

Cellulose ou dérivé des cellulose, agarose : ils doivent être poreux pour permettre pénétration d’une protéine → rentre dans bille*

Question 8

Quelles sont les deux classes d’échangeurs :

Answer 8

Échangeurs anioniques : portent chargent positive

Échangeurs cationiques : charge négative

Question 9

Différence entre échangeur fort et faible?

Answer 9

échangeur fort reste pleinenement chargé entre pH 3-10

échangeur faible est chargé dans pH restreint

Question 10

Comment se lient les protéines aux échangeurs ?

Answer 10

Par des forces électrostatiques (ionique)

Question 11

Comment la protéine se lie avec l’échangeur malgré les contre-ions?

Answer 11

La protéine doit posséder une + grande affinité pour l’échangeur que les contre-ions, elle doit donc aussi les déplacer pour s’attacher.

Question 12

Comment sont choisis le pH et la concentration saline d’une solution avec un échangeur?

Answer 12

Choisis de sorte que la protéine d’intérêt se trouve immobilisé sur l’échangeur d’ions. + l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée

Question 13

Lavage se produit lorsque :

Answer 13

protéine est sur le haut de la colonne (est resté en suspension dans la solution)

Question 14

Comment est lavée la solution de protéine ?

Answer 14

avec une solution tampon

Question 15

À quoi sert l’Élution fractionnée

Answer 15

Protéine liés à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage

Question 16

Quels sels utilisés pour l’élution ?

Answer 16

KCl ou NaCl

Question 17

Comment fonctionne l’élution fractionnée?

Answer 17

Le sel déplace la protéine : les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine.

Question 18

Procédé par élution par gradient

Answer 18

L’utilisation d’un gradient linéaire, permet de libérer une apres les autres les différentes protéine lié à l’échangeur selon leur affinité

Question 19

Comment fonctionne la chromatographie par gel-filtration?

Answer 19

Les molécules sont séparées selon leur taille et forme

Question 20

Sur quoi repose les principes de la chromatographie. par gel-filtration

Answer 20

1) phase stationnaire (résine) consiste à un réseau de polymère réticulé possédant des pores-> sous forme de billes
2) les pores sont grands afin de laisser les petites molécules pénétrer, mais pas toutes les protéines, ceux qui ne pénètre pas traversent rapidement la colonne

Question 21

Quels sont les polymère utilisés pour le gel-filtration?

Answer 21

Des polymères insolubles à base de polysaccharides come le Dextrane ou l’agarose

Question 22

De quoi dépend la porosité des gels ? (les pores)

Answer 22

• de la masse moléculaire du polymère
• du nombre de liaison croisées qui se forment entre les molécules (pontage)

Question 23

Que vaut l’unité Da

Answer 23

1/12 de la masse de Carbone 12

Question 24

Qu’est-ce que la limite d’exclusion des pores?

Answer 24

capacité des pores à exclure des macromolécules selon leur taille. Varie de 0.8 à 800 kDa

Question 25

Par ordre, quel taille sera éliminés en premier lors du gel-filtration

Answer 25

Les grosse molécules qui ne pénètrent pas les pores.

Question 26

Comment déterminé le volume d’élution d’une protéine

Answer 26

C’est le volume de solvant nécessaire e pour
éluer la protéine après son dépôt sur la colonne.
Vt = Vx + Vo
- Vx = le volume occupé par les billes
- Vo = le volume mort (volume de solvant qui entoure les billes, ~35% de Vt)
- Vt = le volume total de la colonne

Question 27

À quoi sert le volume d’élution relatif d’une protéine ((Ve/Vo)?

Answer 27

Permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine.

Question 28

Que fait la dialyse ?

Answer 28

Permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à des membranes semi perméables qui présentent des pores de taille inf. aux prots. (diffuse sels et petites molécules à travers membrane)

Question 29

Pourquoi utilisé la dialyse ?

Answer 29

Utilisée pour éliminer les sels présents dans
un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après
élution avec un tampon riche en sels.

Question 30

À quoi sert la Centrifugation sur colonne?

Answer 30

Sépare protéine selon poids moléculaire.

Question 31

Qu’est-ce que la chromatographie d’affinité (technique)

Answer 31

Un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est
fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte, protéine d’intérêt se lie au ligand immobilisé et autres prots sortent de la colonne.

Question 32

Quels propriétés utilisent la Chromatographie d’affinité?

Answer 32

Les propriétés biochimiques uniques d’une protéine d’intérêt.

Question 33

Qu’est que le Kd dans une liaison protéine-ligand?

Answer 33

La constance de dissociation (mesure d’affinité protéine-ligand)

Question 34

Comment doit être la matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité?

Answer 34

• chimiquement inerte
• grande porosité
• présenter de nombreux
  groupes fonctionnels capables de
  former des liens covalents avec les ligand

Question 35

Quel polymère est le plus utilisé en tant que matrice pour la liaison d’un ligand à une matrice?

Answer 35

L’agarose

Question 36

Comment se fait le lien covalent entre le ligand et la matrice d’agarose?

Answer 36

1- réaction agarose avec bromure de cyanogène
2- ligand réagit avec agarose activé -> produit lié par covalence
*problème : protéines peuvent intérférer
*solution : bras espaceur

Question 37

Que fait un bras espaceur ?

Answer 37

Permet à la protéine d’avoir accès au ligand.

Question 38

Quelles sont les méthodes utilisées pour détecter des protéine lors de l’élution d’une colonne chromatographique?

Answer 38

• absorption des protéine dans l’UV (280nm)
• essai colorimétrique (produit réagit avec prots -> couleur mauve)
• essai enzymatique
• détection prots sur gel SDS-PAGE : montre degré de pureté
• détection prots avec anticorps : très spécifique