BCM TP Cours 1 Flashcards
Première étape de la méthode de solubilisation? (purification des protéine)
Dissoudre dans une phase liquide les protéines
Méthode la plus douce et simple pour killla cell contenant des protéines ?
La lyse osmotique
cellules dans solution hypotonique-→ provoque éclatement de la cellule (+ efficace pour cellule animale car pas de paroi)
pour les parois, utilisation de lysozyme
Avant d’isoler la protéine d’intérêt les tissus exigent une désintégration mécanique pour accéder à leur contenu. Quelles sont les méthodes?
Broyage avec du sable, Déchiquetage mécanique (blender), Homogénéisateur, Rupture par haute pression, Sonification.
une fois cellule brisée, le lysat peut être filtré pour obtenir protéine d’intérêt
Comment savoir si un lysat a bien été segmenté/filtré?
En utilisant un marqueur moléculaire (montre si bien isolé)
La protéine doit rester stable, ce qui tient compte de +sieurs facteurs, que sont ils?
pH : utilisation de solution tampon qui garde le pH → 6,5-7,5/8
Température : doit rester à base température 0-5 degré, se dénature à 25 degré
Protéases : peuvent dégrader protéine lors de purification, ajout d’inhibiteurs de protéase peut empêcher dégradation.
Protéine purifiées par des méthodes de fractionnement, Utilisation des différentes propriétés physico-chimiques :
solubilité
charge ionique
taille moléculaire
propriétés d’adsorption et liaison à d’autres mols
approche couramment utilisé pour purifier une ou des protéines (diminuer sélectivement:
Les précipiter
La solubilité d’une protéine dépend :
des interactions polaire avec le solvant aqueux
interactions ioniques avec les sels en solution
forces électrostatique répulsives entre mols ou agrégats de charge similaire
Qu’exige la précipitation ?
La formation d’agrégats de protéine
Variation utilisé pour diminuer solubilité d’une prots
force ionique (concentration saline)
pH
ajout de solvant organiques
ajout de polymère inertes
(on peut favoriser la précipitation avec ces facteurs)
Qu’est-ce que le salting in?
À la zone de force ionique de 0 - 0,5M, augmentation en solubilité avec une concentration croissante en sels. (défavorise l’isolement de la protéine)
Pourquoi le salting in défavorise la formation de l’agrégat (défavorise isolement)
Car les sels lient directement les protéines et augmente leur charge nette, favorise solubilité :
les sels augmentent interactions avec l’eau
augmentent la répulsion entre protéine (diminue agrégation)
Quand est-ce que le salting in peut être utile?
pendant la purification, lorsqu’on veut dessaler (SALTING OUT) la protéine par dialyse (dialyse contre un tampon de faible force ionique peut provoquer précipitation des protéines)
Qu’est-ce que le salting out? (Déssalage)
technique utilisé pour purifier des protéines (hautes concentrations de sel)-→ compétions entre les ions salins ajoutés et les prots pour la solvatation (accès au molécule d’eau)
Pourquoi le salting out favorise les précipitations?
compétition entre ions salins et protéine pour avoir accès aux molécules d’eau, résultat : diminution de la solvatation des protéines, les protéines auront moins de surface solvatée, ce qui favorisera leur agrégation.
FONCTION DE L’HYDROPHOBICITÉ DE LA PROTS, LES RÉGIONS HYDROPHOBES SERONT LES PREMIÈRES À ÊTRE - BIEN SOLVATÉES.
Qu’est-ce qui favorise la précipitation des protéines? Haute ou basse concentration de sel
Une haute concentration de sels
RÉSUMÉ DESSALAGE (salting out)
- une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d’une protéine.
au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés, les molécules d’eau libres deviennent peu nombreuses.
Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes
ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec de l’eau
Sorte de sel qui se lie et interagit directement avec la protéine et qui peut avoir un effet déstabilisant
Chaotropique
Sorte de sel qui encourage hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans intéragir avec la protéine
sels optimaux
La série Hofmeister
sulfate d’ammnium (N4)2SO4 est le sel le plus utilisé en précipitation
Que fait l’addition d’un solvant msicible avec l’eau comme l’éthanol ou l’acétone?
Ça diminue la solubilité des protéines
Résumé salting in
augmentation de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de faibles concentrations de sels
les ions salins interagissent directement avec les protéines
- les ions de même charge augmentent la répulsion entre protéines, ce qui réduit leur agrégation ® favorise leur solubilité
- ces ions (qui sont hydrophiles) augmentent les interactions des protéines avec le solvant aqueux ® favorise leur solubilité
Résumé salting out
:diminution de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de hautes concentrations de sels.
- les ions salins n’interagissent pas avec les protéines
l’ajout de hautes concentrations de sels très hydrophiles amène la séquestration des molécules d’eau par ces ions
- la quantité de molécules d’eau disponible pour solubiliser les protéines diminue
- les régions hydrophobes des protéines seront déshydratées en premier lieu ce qui favorisera le rapprochement des régions hydrophobes des protéines (via interactions hydrophobe ->effet goutte d’huile)
Tendance à une protéine au pH isoélectrique?
Tendance à devenir moins soluble, car charge globale nette près de 0 minimise la répulsion électrostatique, attirance entre les molécules→ agrégation→ précipitation (se nomme précipitation isoélectrique)
Qu’arrive t-il à l’eau lorsqu’on ajout solv org?
réduit pouvoir de l’eau de solubiliser une macromolécule chargée , à cause d’une réduction de la constante diélectrique de l’eau (pouvoir solvatation)
facteur qui détermine solubilité dans un solvant aqueux/org?
Taille de la protéine : + grande est la prots, + basse est la concentration en solvant organique nécessaire pour précipiter, car surface + grande, donc meilleur chance d’avoir une région chargée complémentaire avec une autre protéine.
Propriété physico-chimique : solubilité , quelle technique utilisée?
précipitation
Propriété physico-chimique : charge ionique, quelle technique utilisée?
- chromatographie par échange d’ions
- électrophorèse
- focalisation isoélectrique
Propriété physico-chimique : taille moléculaire, quelle technique utilisée
- ultracentrifugation
- chromatographie par gel-filtration
- électrophorèse
Propriété physico-chimique :spécificité, quelle technique utiliser?
- chromatographie d’affinité
