Bakterier, transposoner och bakteriegenetik

Question 1

Vilka organismer räknas som mikroorganismer och vilka av dem är eukaryota/prokaryota?

Answer 1

Prokaryota: Bakterier och arkéer
Eukaryota: Protister, Alger, Jäst

Inte mikroorganismer: Virus och bakteriofager.

Question 2

Redogör för skillnader mellan grampositiva och gramnegativa bakterier.

Answer 2

Grampositiva - gramnegativa
Ett membran (PG) - två membran (PG och ytter)
Tjock PG (ca 40 skikt) - tunn PG (1-2 skikt)
PG skikt binds samman med peptidbrygga - peptidbindning
Mycket tvärbindning i pep - mindre tvärbindning
Har teikonsyra i cellväggen - Yttermembran av lipopolysackarider (LPS)
Blir violett - blir rosa (med gramfärgning)

Question 3

Cellmembranet är halvflytande hos alla organismer och är amfipatiskt, vad innebär det?

Answer 3

Att det är halv-hydrofil (vattenälskande) och halv-hydrofob (vattenhatande)

Question 4

Ge tre exempel på funktioner som sköts av cellmembranet.

Answer 4

• transport in och ut (tex näring un och avfallsprodukter ut)
• proteinsyntes för export m.h.a membranbundna polysomer
• energi (ATP): respiration
• rörlighet: rotation av flageller

Question 5

Bakterier kan ha olika så kallade cellbihang, ge exempel på två typer och förklara kort deras funktion.

Answer 5

Flageller: trådlika strukturer som används för rörelse, 1μm - 70μm långa och består av flagellin.
Pili/fimbrier: Små utskott som är kortare men fler än flageller, ofta inblandade i virulens (eller sex). Dessa används bl.a. för vidhäftning i bakterier, ytor, andra typer av celler (tex människoorgan)

Question 6

Vad innebär kapslar och biofilm när man pratar om bakteriers skydd?

Answer 6

Bakterier kan bilda en slemkapsel av
polysackarider/glykoproteiner som skydd mot fagocytering. Dessa kapslar kan sedan gå ihop med kapslar runt andra bakterier och tillsammans bilda så kallad biofilm, som ger skydd mot tex antibiotika.

Question 7

Vad innebär egentligen persisters?

Answer 7

Persisters är bakterier som är genetiskt identiska andra i en population, men hamnar i ett “sovande” tillstånd och är metaboliskt inaktiva. Detta gör dem motståndskraftiga mot antibiotika. Verkar bildas spontant men mer under stress.

Question 8

Vad innebär horisontell genöverföring? Vilka fyra typer av horisontell genöverföring finns?

Answer 8

Horisontell genöverföring är ett samlingsnamn för hur genetiskt material kan överföras mellan bakterier/prokaryoter.

Detta kan ske genom 1. plasmider (konjugation, transformation), 2. fritt DNA som tas upp (transformation) eller 3. fager (transduktion), 4. Mobilt DNA (alltså transposomer etc) via konjugation, transformation eller transduktion.

Question 9

Prokaryoter har inga RNA-transposoner. Vilka två typer av transposabla element det finns i prokaryoter?

Answer 9

IS element (insertionssekvens) och Tn-element (bakteriella transposoner)

Question 10

Hur är IS och Tn element uppbygga och vad skiljer dem åt?

Answer 10

IS element är den enklaste formen av transposon hos bakterier, har bara en gen - transposasgenen (som behövs för transposition). Är mellan 700 bp och över 2 500 bp långa och har ITRs (inverterade terminala repetetiva sekvenser) mellan 9-41 bp långa på båda sidor. Är cut-and-paste och kan hoppa in och ut ur DNA.

Tn-element: större än IS-element och har egna gener (för tex antibiotikaresistens). Kan delas upp i komposit- och icke komposit-transposoner.

Question 11

IS-element kan bidra till att sprida antibiotikaresistens, men hur går det till när de inte har nån annan gen än transposasgenen?

Answer 11

Om flera kopior av samma IS element finns i en kromosom/plasmid kan homolog rekombination mellan IS elementen ske och det kan leda till att gener för antibiotikaresistens “läggs till” i plasmider. Resistensgenerna kommer alltså ej från IS-elementen!

Dessa plasmider (F-plasmider) replikeras och den nya kopian kan sedan föras över till andra bakterier i kolonin via konjugation och på så sätt sprids resistens-genen effektivt.

Question 12

Vad skillnaden är mellan komposit transposoner och icke komposit transposoner i prokaryoter?

Answer 12

Komposit transposoner är flankerade av IS-element och uppkommer genom att två IS element hoppar in nära varandra, på vardera sida om tex en resistensgen.

Icke-komposit transposoner är INTE flankerade av IS-element utan innehåller gener (transposas, resolvas och t.ex. antibiotika resistens) med ITRs på båda sidor. Denna typ av transposon är replikativ (inte cut-and-paste)

Question 13

Vad är inverterade repetitiva sekvenser/inverted terminal repeats (ITRs) och vart hittar man dem?

Answer 13

ITRs är korta DNA sekvenser som är identiska men inverterade mot varandra, tex TGGCCA i 5-3’ riktning och ACCGGT i 3-5’ riktning.

Question 14

Hur uppkommer så kallade flankerande direkta repetitiva element (FDR)?

Answer 14

FDRs hittas på vardera sida om transposoner för att enzymet transposas klyver i dessa frekvenser (målsekvenser) och när DNA strängen byggs på blir sekvensen samma på båda sidor om transposonen.

Question 15

Vad är funktionen av enzymet transposas?

Answer 15

Transposas klyver ut transposoner genom att känna igen ITRs i utkanten av transposonerna och klyva där.

Question 16

Vad innebär det att en transposon är replikativ respektive icke-replikativ (cut-and-paste)?
Vilka transposoner tillhör dessa olika kategorier?

Answer 16

En replikativ transposon kopieras och sätts in på ett till ställe i genomet. De som ingår i kategorin är: Icke-komposit transposoner (typ av tn-element)

En icke-replikativ transposon “klipps ut” ur genomet och sätts in någon annanstans. Ingår: IS-element, komposit transposoner.

Question 17

Hur kan antibiotikaresistens spridas med hjälp av transposoner i korta drag?

Answer 17

Med IS-element mha homolog rekombination. Med Tn-element genom plasmider och eller homolog rekombination. Konjugativa plasmider kan flytta antibiotika-resistens gener mellan bakterier.

Question 18

Hur regleras transpositionen av Tn10?

Answer 18

Metylering av promotorn till transposasgenen, men metylering är långsam så under en liten stund är promotorn hemimetylerad (bara gamla strängen metylerad efter replikation) - detta leder till uttryck av en transposas per replikation (inte så mycket!) Samma mekanism som mismatch repair i E. coli.

Question 19

En mycket svårt sjuk person kommer in på akuten. Symptomen tyder på någon typ av bakteriell infektion. Det är osäkert vilken bakterie som orsakar sjukdomen
men behandling bör omedelbart påbörjas.

Om du var läkare, vilket antibiotikum skulle du välja för behandling och varför?

Answer 19

Jag skulle använda en tetracyklin pga dess breda spektrum. Eftersom patientens symptom är akuta och behandling måste båbörjas direkt är det bättre att gå det säkra före det osäkra trots att tetracykliner har mycket biverkningar.

Question 20

Hur är genetiken annorlunda för bakterier jämfört med tex flercelliga organismer som människan?

Answer 20

Bakterier förökar sig genom binary fission (tvåsam tudelning) men kan dela gener genom så kallad bakteriesex eller få nya gener på andra sätt, som upptag av fritt DNA eller via fager. Detta är dock INTE kopplat till reproduktion på något sätt.

Question 21

Vad innebär det att en bakterie är prototrof?

Answer 21

En prototrof bakterie (vildtyp) kan själv syntetisera alla komponenter den behöver för tillväxt, tex aminosyror, nukleotider, vitaminer. Behöver bara kolkälla och salter.

Question 22

Vad menas med en auxotrof bakterie?

Answer 22

En auxotrof bakterie (mutant) saknar förmågan att själv syntetisera en eller flera viktiga komponenter (organiska föreningar) för tillväxt, tex aminosysra. Den förening den inte kan syntetisera behöver därför finnas i mediumet vid odling.

Question 23

Vilka olika typer av tillväxtmedium används vid bakterieodling och vilken typ av bakterie växer på dem olika typerna?

Answer 23

De två typerna är minimalmedium och komplett medium.

Auxotrofa bakterier växer på komplett medium eftersom det innehåller de föreningar den behöver för tillväxt. (innehåller - Jästextrakt – från jästceller, ger aminosyror, kol och energikälla, NaCl, pH 7.5, Trypton – kasein – mjölkproteiner (aminosyror))

Prototrofa bakterier växer på minimalmedium eftersom de kan producera allt de behöver. Innehåller någon kolkälla (tex glukos) + salter.

Question 24

Vilka är de tre sätten bakterier delar genetisk information på?

Answer 24

Transduktion - DNA överförs med bakteriofager
Konjugation - DNA överförs från en bakterie till en annan
Transformation - fritt DNA tas upp från omgivningen

Question 25

Beskriv konjugation kortfattat.

Answer 25

DNA överförs från en bakterie till en annan via direkt kontakt mellan dem. Gen från den ena ERSÄTTER befintliga gener hos mottagaren.

Question 26

Hur fungerar konjugation av plasmider i detalj?

Answer 26

När en F+ (fertility) cell och en F- cell kommer i kontakt (cell-cell kontakt) sker ibland konjugation.

1. Kontakten mellan de två bakterierna etableras av konjugationspilus (som kodas för av transfer gener) som växer ut från givaren och binder till en receptor hos mottagarcellen och drar på så sätt mottagaren till sig så att de hamnar i direktkontakt.
2. F+ cellen har en F-faktor (plasmid som kodar för sexpilus bl.a.) som ett specifikt endonukleas klipper upp och kvarstår kopplat till DNA trådens 5’ ände och styrs över till mottagarcellen som enkelsträngat DNA. Samtidigt som övergången sker pågår en nysyntes av DNA strängen i givarcellen och i mottagarcellen pågår komplementärbasparning för att skapa en dubbelsträngad plasmid i slutändan. Tillslut har båda cellerna en identisk dubbelsträngad kopia av F+ plasmiden och är båda F+ celler.

Question 27

Vad innebär en Hfr-cell?

Answer 27

Hfr-cell står för “high-frequence recombination”. En Hfr-cell är en cell med en F-plasmid integrerad i kromosomen. Dessa har en rekombinationsfrekvens 1000 ggr högre än vanligt.

Question 28

F-faktorn kan alltså föras över som plasmid, men vad behövs för att rekombination i kromosomen ska ske?

Answer 28

För att rekombination skall ske måste F-plasmiden INTEGRERAS i genomet hos F+ cellen - detta sker slumpvis väääldigt sällan, alltså med en väldigt låg rekombinationsfrekvens.

Question 29

När Hfr celler konjugerar med F- celler FORTSÄTTER

dessa att vara F- , varför?

Answer 29

Pga att Hfr-celler redan har F-plasmiden integrerad och nicken på DNA sker i skarven mellan plasmiden och resten av kromosomen skulle F-plasmiden vara det sista som förs över. Konjugationen varar inte så länge att F-faktorn kommer med, vilket är varför Hfr x F- = F-.

Question 30

Vad innebär “interrupted mating technique”?

Answer 30

Interrupted mating technique är en metod som används för att mappa i vilken ordning givargener ligger genom att man studerar sekvensen i vilken generna anländer i mottagarcellen med över tid.
Integrationspunkten för F-plasmiden = startpunkten för överföring

Question 31

Vad är en plasmid och hur förökar den sig?

Answer 31

En plasmid är en cirkulär bit DNA ca 100 bp som kan innehålla gener för överföring via konjugation (F-faktor eller R-plasmid). Kopietalet varierar för olika plasmider och plasmider som inte kan konjugera används oftast i forskning så att de inte kan spridas.

Plasmider replikeras av värdcellens replikationssystem

Question 32

Hur går transformation till?

Answer 32

Transformation sker i två steg:

1. Fritt extracellulärt dsDNA binder till receptorer på mottagarcellen och kommer in i cellen med aktiv transport.
2. Ena strängen av dsDNA bryts ner av nukleas så att endast esDNA finns fritt i cellen. Rekombination av ssDNA sker med homologa sekvenser på kromosomen och ett heteroduplex uppstår samtidigt som det utbytta DNAt degrederas. När kromosomen sedan replikeras kommer den ena dottercellen ha det nya DNAt integrerat medan den andra inte har det.

Question 33

Hur går transduktion till?

Answer 33

En bakteriofag för med sig prokatryota gener från en värdcell till en annan av misstag. Detta kan ske om ett fel uppstår under virusets replikeringscykel och den råkar packa in prokaryot DNA i huvudet istället för sitt eget. När fagen (lysogen) med prokaryot DNA i huvudet sedan angriper en annan prokaryot cell släpper den in DNAt istället för “sitt eget”.

Question 34

Förklara skillnaden på lytisk och lysogen fag.

Answer 34

En lysogen fag lyserar ej cellen utan dess DNA integreras i bakteriens kromosom (profag).

En lytisk fag replikeras inuti en cell och när tillräckligt många fager bildats lyseras cellen med enzymet lysozym som bryter ner cellväggen och fagerna släpps ut.

T.ex. UV-ljus eller olika kemikalier kan inducera lysogen fas att bli lytisk

Question 35

Hur används antibiotika i naturen?

Answer 35

Organismer tex svampar eller prokaryoter utsöndrar antibiotika för att slå ut konkurrenter i samma nish.

Question 36

Ingen annan klass av mediciner eller medicinsk teknik har varit så viktig för att minska mänsklig sjukdom och mortalitet som antibiotika. Hur och när använder vi det idag?

Answer 36

1. För att behandla bakterieinfektioner i primärvåd
2. För att behandla (förebygga) infektion för patienter med svagt immunförsvar, tex för tidigt födda barn,
   cancer, HIV smittad.
3. Vid avancerade kirurgiska ingrepp som organtransplantation eller proteskirurgi.

Question 37

Förklara vad som visas i ett antibakteriellt spektrum/aktivitetsspektrum.

Answer 37

I ett antibakteriellt spektrum visas vilken/vilka olika bakterier som hämmas av olika antibiotikum. I dem kan man utläsa om ett antibiotikum har ett brett eller smalt spektrum.

Question 38

Vad bestämmer vilket antibiotikum man använder? (5)

Answer 38

1. Brett eller smalt spektrum
2. Toxicitet och potentiella bi-effekter (patientfaktorer)
3. Resistensproblematik
4. Administration
5. Kostnad

Question 39

Vad är antimetaboliter?

Answer 39

Preparat som hämmar metaboliska processer

Question 40

Vad innebär ett selektivt antibiotikum?

Answer 40

Att det exklusivt dödar bakterier och inget annat.

Question 41

Förklara följande begrepp: Biverkningar, bakteriocidiskt och bakteriostatiskt.

Answer 41

Biverkningar – toxiska effekter för den som behandlas
Bakteriocidiskt – dödar bakterier
Bakteriostatiskt – hämmar bakteriers tillväxt (dödar ej)

Question 42

Vad innebär MIC värde?

Answer 42

MIC (Minimum Inhibitory Concentration) värdet anger vilken den minsta koncentrationen som hämmar synlig bakterietillväxt är.

Question 43

Vid många infektioner använder vi en så kallad kombinationsbehandling, vad innebär detta?

Answer 43

Kombinationsbehandling innebär behandling med flera olika AB eller med ett AB+andra läkemedel.

Question 44

Förklara följande begrepp med avseende på kombinationsbehandling: antagonism, synergism och additiv effekt

Answer 44

Additiv effekt - Effekten av två antibiotika är lika med summan av deras enskilda effekter.
Synergism - Effekten av två antibiotika är större än summan av deras enskilda effekter.
Antagonism - Effekten av två antibiotika “cancels eachother out”, alltså blir mindre än summan av dess enskilda effekter.

Question 45

Antibiotika slår ut bakterier genom att angripa metaboliska processer. Ange tre typer av antibiotika och vilka verkningsmekanismer vardera har.

Answer 45

Pencilliner (β-laktamer): Hämmar cellväggssyntesen

Tetracykliner (aminoglykosider): Hämmar proteinsyntesen

Rifampicin (A) och kinoloner (B): Hämmar nukleinsyrasyntesen, A - RNA och B - DNA.

Sulfonamider (sulfa): hämmar folsyrametabolismen.

Question 46

Hur verkar cellväggssyntesinhibitorer? Namnge två vanliga sådana.

Answer 46

Genom att hämma transpeptidering, eller cross-linking (bindningar som håller cellmembranet samman)

Vankomycin och β-laktamer

Question 47

Vad är vankomycin?

Answer 47

Vankomycin är ett AB som produceras naturligt av aktinobakterier och är aktivt mot gram-positiva bakterier (kan inte ta sig igenom yttermembran hos G-). Vankomycin används som SISTA utväg mot bl.a. blod- och bukhinneinfektion & stafylokocker.

Question 48

Hur verkar vankomycin och hur kan resistens mot det uppkomma?

Answer 48

Verkar genom att hämma transpeptidering: Binder till de avslutande D-Ala-D-Ala på peptidkedjan bunden till NAM.

Resistens mot detta uppnås genom mutation så att den sista aminosyran blir D-laktat ist för D-ala, vilket hindrar vankomycinbindning.

Question 49

Vad är β-laktamantibiotika?

Answer 49

Tex Penicilliner och Cefalosporiner är β-laktamantibiotika och denna typ av AB står för ca 55% av AB-användningen i Sverige idag då de har ett brett spektrum. De är bakteriocida (dödar bakterier) och har få sidoeffekter eftersom de går på bakteriespecifika processer.

Question 50

Hur verkar β-laktamantibiotika och hur kan resistens mot det uppkomma?

Answer 50

Verkar genom att β-laktamer binder kovalent till transpeptidas (också kallat PBP: penicilling binding proteins) så att det inte kan binda till tetrapeptiden. Detta på grund av att β-laktamer är så likt cellväggsprekursorn, så traspeptidaset tar fel. Detta leder till att ingen cross linking sker –> gradvis försvagning av cellvägg som tillslut brister.

Resistens kan uppkomma genom mutation som ger gen som förstör β-laktamer, eller mutation som förändrar transpeptidaser (PBPs) som b-laktamer inte längre kan binda till då.

Question 51

Hur verkar generellt Proteinsyntesinhibitorer?

Answer 51

De hämmar proteinsyntes genom att binda till ribosomer, antingen reversibelt (Tetracykliner) eller irreversibelt (Aminoglykosider: Streptomycin, neomycin, gentamycin)

Question 52

Hur kan resistens mot proteinsyntesinhibitorer uppkomma?

Answer 52

Aminoglykosider:

• Resistens via enzymer som modifierar AB så att ej kan binda till ribosomen
• Resistens via förändringar i ribosomen som hindrar bindning

Tetracykliner: Resistens är mycket vanlig och
sker via effluxpumpar eller
ribosomala förändringar - ofta plasmidbunden.

Question 53

Ge exempel på två Nukleinsyrasyntesinhibitorer och ange hur de verkar.

Answer 53

DNA:
Fluorokinoloner t.ex (nalidixan/nalidinsyra): Binder till α-subenheten i DNA gyras vilket hämmar DNA supercoiling/replikation
och ger dubbelsträngsbrott i DNA vilket dödar bakterierna effektivt.

RNA:
Rifampicin: Bildar ett stabilt komplex med bakteriens RNA-pol, vilket hindrar initiering av transkription.

Question 54

Hur kan resistens mot Nukleinsyrasyntesinhibitorer uppkomma?

Answer 54

Rifampicin: Resistens genom mutationer i genen för RNA-polymeras

Fluorokinoloner : Resistens genom mutation i bl.a. gyrA

Question 55

Hur fungerar folsyrasyntesinhibitorer generellt?

Answer 55

Människoceller kan inte tillverka folsyra, som används som byggsten vid purinbiosyntes. Många bakterier kan däremot tillverka folsyra från para-amino benzoeic acid (PABA)

Den syntesvägen är ett bra mål för antibiotika som Sulfa (sulfonamider): hämmar enzymet dihydropteroat syntetas genom att vara strukturellt likt dess normala substrat, PABA.

Question 56

Ge exempel på två folsyrasyntesinhibitorer och ange dess verkningsmekanism i korthet.

Answer 56

Sulfonamider:
Hämmar enzymet dihydropteroat
syntetas genom att vara strukturellt likt dess
normala substrat, PABA.

Trimetoprim:
hämmar enzymet
dihydrofolatreduktas som agerar vid nästa steg i
folsyrabiosyntesen.

Question 57

Ange tre biverkningar vid antibiotikabehandling och hur man hanterar dessa.

Answer 57

.

Question 58

Vilka är de fyra generella resistensmekanismerna?

Answer 58

1. Förändring av målmolekylen - antibiotikumet kan ej binda. I regel kromosomal men genen kan överföras till plasmid via transposon. Tex penicillin, rifampicin.
2. Förändring av antibiotikamolekylen - AB-molekylen klyvs eller förändras kemiskt av enzym. Generna som kodar för enzymet kan vara kromosomala eller plasmidburna.
3. Förändring av permeabiliteten/utflödet (efflux) - förändring i sekretionssystem som effektiviserar utpumpning av antibiotika. Kan vara plasmid, kromosomal eller via transposon.
4. Förändrad tillväxt: biofilm eller persisters: biofilm ger mer resistens/skydd och persisters är helt opåverkade av ab.

Question 59

Vad innebär MRSA?

Answer 59

Meticillin resistant S. Aurelius. En multiresistent bakterie som är väl utbredd i världen.

Question 60

Hur kan det gå till när multiresistenta bakterier uppkommer? Ge exempel på multiresistenta bakterier.

Answer 60

Meticilin utvecklades för att behandla penicillin resistenta S. aureus - mutationen som orsakade resistensen till detta gjorde bakterien resistent mot ALLA beta-laktamas → MRSA (multiresistent S.aureus), som är väl utbredd i världen. Sista effektiva behandlingen är vankomycin men 2002 hittade man Vankomycinresistenta S.A (VRSA)

ESBL - extended spectrum beta-lactamase - muterad bakterie med enzym som hydrolyserar
de flesta beta-laktam klasserna.