aula 5 -imunohistopatologia Flashcards
Para que serve a imunohistoquimica?
para detetar marcadores específicos de proteínas
e que informações podemos obter dos marcadores?
morfologia e estrutura celular
mecanismos celulares
sinalização celular
localização de proteinas
o que é que a informação dos marcadores pode ajudar a desenvolver
-novos fármacos
-diagnósticos e tratamentos de cancro
-neurociências
passos após o imunohistoquimico staining
1) despolarização e rehidratação da amostra
2)Recuperação de antigénios
3) blocking
4) imunohistoquimico staining
5) contra-coloração
6) estabilização com o meio de montagem
sobre a recuperação de antigénios (2) o que acontece nesta etapa?
Os agentes de fixação competem com os anticorpos pela ligação aos epítopos dos antigenios, pelo que esta etapa reverte a ligação
o que a competição entre os agentes de fixação e os anticorpos podem provocar?
Staining fraco ou falso negativo
que tipos de recuperação de antigénios podem ocorrer
heat-induced epitope retrieval (HIER) -MÉTODO MAIS COMUM
Proteolytic-induced epitope retrieval (PIER)
explica o HIER
HIER (Heat-Induced Epitope Retrieval) é um método que usa calor para recuperar epítopos mascarados após a fixação com formalina, permitindo que os anticorpos se liguem eficazmente durante a coloração.
-maior impacto na morfologia
-sensível ao tipo de buffer, pH, tempo e ºC
-buffer comum: citrato
explica o PIER
recurso a peptidases para quebrar ligações do agente fixador do epítopo
-impactos podem ser mais negativos nas células
-usado em lig. difíceis de quebrar
peptidases comuns: tipsina, pepsina, protease K
Define blocking (3)
minimiza a ligação não especifica dos anticorpos
-uma boa frase é “altera a fechadura para que apenas a minha chave dê para entrar e mais nenhuma, nem mesmo uma chave mestra, não específica.”
tipos de blocking (3) e explica-os
bloqueio das lig iónicas não específicas- blocking non-specific ionic bindings
-> baseia-se na diluição do anticorpo de interesse em buffers com diferentes [] iónicas, minimizando as lig ñ especificas dos anticorpos
-bloqueio das enzimas endógenas
-> alguns métodos de coloração utilizam sub presentes nas cél. minimizando a interferência endógena no sinal detetado
quanto ao ponto 4) imunohistoquimico staining qual a diferença entre o método direto e indireto
o direto é quando um anticorpo já marcado se liga ao antigénio
-BOM: é mais rápido e simples
-MAU: obtemos um sinal fraco e anticorpos primários com marcação são caros
o indireto é quando o antigénio se liga a um anticorpo primario e a este liga-se um secundário marcado
- BOM: amplifica o sinal e é mais barato
Como escolher um anticorpo no passo 4?
pela literatura e ver se é melhor monoclonal ou policlonal
monoclonal vs policlonal (são literalmente o oposto por isso dizer só 1)
monoclonal:
+ caro
reage apenas com 1 epitopo
reconhece apenas1 forma de 1 proteina
população homogénea
sensivel a pH, tipo de tecido e buffer
como escolher o marcador
cromogénico (com enzimas e insolúveis)
-mais complexos
-mais sensiveis
-menos cores
-pior co-localização
-mais resistentes e duradouros
flurorescência (quando se ligam direta ou indiretamente aos antigénios)
oposto do de cima
-mais suscetível a photobleaching (enfraquecimento do sinal por exprosição à luz)
o que faz a contracoloração (5)?
A contracoloração realça o contraste entre diferentes estruturas celulares e teciduais, tornando mais visível o que foi corado especificamente.permite obter info morfológicas adicionais
cromogénica : H&E
fluorescência: DAPI e FITC
para que se estabiliza o meio de montagem? (6) (+ impt para a fluorescência)
aumenta a fluorescência e protege dos fluóforos do fotobranqueamento
