APP-3.1 réaction de polymérisation Flashcards
je suis utiliser pour produire une grande qté de copies d’une séquence d’ADN précise à l’aide d’une enzyme nommée __________, qui suis-je? et quelle est l’enzyme
PCR(réaction de polymérisation en CHAINE)
ADN polymérase
comment est-il possible d’amplifier une séquence spécifique
en choisissant les amorces qui délimiteront la séquence
synonyme de ADN à amplifier
matrice, base ou template
je suis l’étape permettant de séparer l’ADN bicaténaire sous forme monocaténaire par le chauffage au-delà de 90 degré celcius afin d’éviter le besoin d’une origine de réplication
étape de dénaturation
comment se nomme les deux amorces délimitantes, quelle est sa position
une amorce sens (se lie au brin 3-5, donc présenté sous forme 5-3)et une amorce anti-sens (présentée sous forme 5-3, mais se lie sous forme 3-5=anti-sens, puisque elle se lie au brin 5-3)
comment se nomme l’ADN polymérase?
Taq polymérase
d’où est prélevée cette ADN polymérase
de la bactérie Thermus aquaticus
quelle est l’avantage à utiliser cette Taq polymérase
sa température optimale de fonctionnement est de 72 degré celcius, donc entre la température d’hybridation (=55) et la température de dénaturation (=90), donc résiste aux hautes températures
par quelle outil est permis la polymérisation en chaine, soit en plusieurs cycles dénat-hybrid-polym?
thermocycleur qui permet le changement de tempérarture raspidement selon l’étape
quelles sont les 5 composantes nécessaires à la réaction
1)ADN matrice: petite, isolé et jeune (agée= tendance à se dégrader)
2) plusieurs copies des 2 amorces délimitantes: plus grande concentration que ADN matrice
3)ADN polymérase: taq polymérase
4)tampon de l’enzyme: métaux(MgCl2, Ca2+) agissant comme cofacteur= assure bon fonctionnement de l’enzyme
5)dNTPs (mélange des désoxyribonucléotide triphosphate): dATP (désoxyadénosine triphosphate), dCTP, dGTP, dTTP
quelles sont les 3 étapes d’un cycle d’une PCR
1) dénaturation
2)hybridation
3)élongation
quelles sont les 3 étapes d’un cycle d’une PCR
1) dénaturation
2)hybridation
3)élongation
comment se nomme la 4eme étape
Réaction en chaîne qui initie un prochain cycle
je suis l’étape de l’Augmentation de la température (90) pour assurer la dénaturation de tous les brins d’ADN matrice ainsi que les amorces. L’ADN devient monocaténaire.
dénaturation
je suis l’étape de Diminution de la température pour
permettre l’hybridation des amorces. Ces oligonucléotides
vont marquer les extrémités de la séquence à amplifier.
Chaque amorce est complémentaire à une partie de la
séquence matrice
hybridation
La température d’hybridation (Th) dépend de quoi?
1) la longueur de l’amorce (plus c’est long=+Th grand)
2)nature nucléotide (+CG=3liens H vs 2liens H=Th+grand)
3) conditions de la réaction
je suis la Température à laquelle 50% des fragments d’ADN seront simple brin et 50% seront double brin.
température de dénaturation (Tm)
le calcul de Tm des amorces
Tm= (A+T)x2+ (C+G)x4
le calcul de Th des amorces
Th=Tm - 5
je suis le fragment produit par PCR parfaitement délimité par les amorces, je suis l’amplification de la séquence cible sur l’ADN matrice. je vais représenter la très grande majorité du produit final, après les cycles
d’amplification.
amplicon
à partir de quelle cycle apparaisse les amplicons?
à partir du cycle 3
quelle est la formule permettant de connaitre le nombre d’Amplicons par rapport au cyles
=2^n-2n où n= #cycles
pourquoi au début l’amplification est exponentielle, ensuite linéaire, ensuite plateau
exponentielle, car aucun agent limitant, car très grande quantité de réactifs (enzymes, amorces dNTPs)
linéaire, car agent limitant puisque la qté de réactifs à diminuer
plateau, car réactifs épuisées
pourquoi il est important d’avoir un excès de réactifs
afin d’éviter l’effet “agent limitant”, d’en avoir assez pour amplifier 30 cycles
Qualitatif. Permet de détecter l’expression de gènes dans différents tissus. Suite à la RÉTROTRANSCRIPTION de l’ARN en ADN, les mêmes étapes de la PCR sont effectuées. La visualisation du résultat permet de déduire grossièrement le niveau d’expression du gène en comparaison à un contrôle.
qui suis-je
RT-PCR
Quantitatif. Utilisation d’un marqueur fluorescent permettant de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel de manière beaucoup plus précise. elle est aussi nommée REAL-TIME PCR
qui suis-je
qPCR
comment le SARS-CoV2 est détectée
, il s’agit d’un virus à ARN. Il faudra donc s’assurer de rétrotranscrire l’ADN viral potentiel pour effectuer le test. De plus, pour obtenir des résultats précis, la technique real-time PCR est généralement utilisée : ceci permet d’avoir une idée de la quantité de matériel génétique virale
initiale retrouvée chez le patient en mesurant le nombre de cycles nécessaires pour obtenir un certain
niveau de fluorescence. La mention “positif” au test dépend d’un niveau minimal obtenu,
il existe plusieurs variantes d’un même gène dans une population d’individus (ex. Aa). En amplifiant le gène d’intérêt et en le séquençant, il est possible d’identifier quel allèle particulier porte un individu donné.
qui suis-je?
identification de polymorphismes (allèle)
À quoi peut servir l’identification de polymorphisme (4)
1) identifier criminel en comparant séquence trouvée sur scène de crime et séquence d’un suspect (injection d’amorces des 2 allèles)
2)test de paternité (injection d’amorces des 2 allèles)
3) diagnostif d’infections (injection d’amorces de gènes viraux et bactériens)
4)diagnostifs prénataux (séquence cible amplifié pour détecter maladies héréditaires/ anomalie chromosomiques)
je suis une forme de PCR, le matériel amplifié est soumis aux agents mutagènes, cloné dans des vecteurs plasmidiques et réintroduit dans un organisme
mutagenèse
qu’est qu’une mutagenèse dirigée, soit variante plus spécifique?
les amorces sont porteurs de la mutations
qu’Est une mutagenèse variante, aussi nommée création d’OGM
la séquence d’un organisme est amplifiée pour etre injecté dans un autre organisme suite aux clonages dans les vecteurs plasmidiques (
comment se forme une sonde
dUTP (se lie avec le ATP portant un P radioactif) est une sonde portant un phosphate radioactif marqué par DIG(stéroïde végétal) qui porte un anticorps associé à une enzyme AP produisant couleur .
à quoi sert la fabrication de sonde et comment elles sont produites?
: les sondes peuvent être produites par PCR
ou avec des vecteurs de propagation.
L’ajout de nucléotides marqués à l’aide de molécules/atomes que l’on peut facilement
détecter (ex. 32P, du phosphate radioactif présent dans le phosphate α de l’ATP) dans les réactifs de la PCR permet d’obtenir une sonde facilement traçable (suivable, observable).
