APP-3.1 réaction de polymérisation

Question 1

je suis utiliser pour produire une grande qté de copies d’une séquence d’ADN précise à l’aide d’une enzyme nommée __________, qui suis-je? et quelle est l’enzyme

Answer 1

PCR(réaction de polymérisation en CHAINE)

ADN polymérase

Question 2

comment est-il possible d’amplifier une séquence spécifique

Answer 2

en choisissant les amorces qui délimiteront la séquence

Question 3

synonyme de ADN à amplifier

Answer 3

matrice, base ou template

Question 4

je suis l’étape permettant de séparer l’ADN bicaténaire sous forme monocaténaire par le chauffage au-delà de 90 degré celcius afin d’éviter le besoin d’une origine de réplication

Answer 4

étape de dénaturation

Question 5

comment se nomme les deux amorces délimitantes, quelle est sa position

Answer 5

une amorce sens (se lie au brin 3-5, donc présenté sous forme 5-3)et une amorce anti-sens (présentée sous forme 5-3, mais se lie sous forme 3-5=anti-sens, puisque elle se lie au brin 5-3)

Question 6

comment se nomme l’ADN polymérase?

Answer 6

Taq polymérase

Question 7

d’où est prélevée cette ADN polymérase

Answer 7

de la bactérie Thermus aquaticus

Question 8

quelle est l’avantage à utiliser cette Taq polymérase

Answer 8

sa température optimale de fonctionnement est de 72 degré celcius, donc entre la température d’hybridation (=55) et la température de dénaturation (=90), donc résiste aux hautes températures

Question 9

par quelle outil est permis la polymérisation en chaine, soit en plusieurs cycles dénat-hybrid-polym?

Answer 9

thermocycleur qui permet le changement de tempérarture raspidement selon l’étape

Question 10

quelles sont les 5 composantes nécessaires à la réaction

Answer 10

1)ADN matrice: petite, isolé et jeune (agée= tendance à se dégrader)

2) plusieurs copies des 2 amorces délimitantes: plus grande concentration que ADN matrice

3)ADN polymérase: taq polymérase

4)tampon de l’enzyme: métaux(MgCl2, Ca2+) agissant comme cofacteur= assure bon fonctionnement de l’enzyme

5)dNTPs (mélange des désoxyribonucléotide triphosphate): dATP (désoxyadénosine triphosphate), dCTP, dGTP, dTTP

Question 11

quelles sont les 3 étapes d’un cycle d’une PCR

Answer 11

1) dénaturation
2)hybridation
3)élongation

Question 12

quelles sont les 3 étapes d’un cycle d’une PCR

Answer 12

1) dénaturation
2)hybridation
3)élongation

Question 13

comment se nomme la 4eme étape

Answer 13

Réaction en chaîne qui initie un prochain cycle

Question 14

je suis l’étape de l’Augmentation de la température (90) pour assurer la dénaturation de tous les brins d’ADN matrice ainsi que les amorces. L’ADN devient monocaténaire.

Answer 14

dénaturation

Question 15

je suis l’étape de Diminution de la température pour
permettre l’hybridation des amorces. Ces oligonucléotides
vont marquer les extrémités de la séquence à amplifier.
Chaque amorce est complémentaire à une partie de la
séquence matrice

Answer 15

hybridation

Question 16

La température d’hybridation (Th) dépend de quoi?

Answer 16

1) la longueur de l’amorce (plus c’est long=+Th grand)

2)nature nucléotide (+CG=3liens H vs 2liens H=Th+grand)

3) conditions de la réaction

Question 17

je suis la Température à laquelle 50% des fragments d’ADN seront simple brin et 50% seront double brin.

Answer 17

température de dénaturation (Tm)

Question 18

le calcul de Tm des amorces

Answer 18

Tm= (A+T)x2+ (C+G)x4

Question 19

le calcul de Th des amorces

Answer 19

Th=Tm - 5

Question 20

je suis le fragment produit par PCR parfaitement délimité par les amorces, je suis l’amplification de la séquence cible sur l’ADN matrice. je vais représenter la très grande majorité du produit final, après les cycles
d’amplification.

Answer 20

amplicon

Question 21

à partir de quelle cycle apparaisse les amplicons?

Answer 21

à partir du cycle 3

Question 22

quelle est la formule permettant de connaitre le nombre d’Amplicons par rapport au cyles

Answer 22

=2^n-2n où n= #cycles

Question 23

pourquoi au début l’amplification est exponentielle, ensuite linéaire, ensuite plateau

Answer 23

exponentielle, car aucun agent limitant, car très grande quantité de réactifs (enzymes, amorces dNTPs)

linéaire, car agent limitant puisque la qté de réactifs à diminuer

plateau, car réactifs épuisées

Question 24

pourquoi il est important d’avoir un excès de réactifs

Answer 24

afin d’éviter l’effet “agent limitant”, d’en avoir assez pour amplifier 30 cycles

Question 25

Qualitatif. Permet de détecter l’expression de gènes dans différents tissus. Suite à la RÉTROTRANSCRIPTION de l’ARN en ADN, les mêmes étapes de la PCR sont effectuées. La visualisation du résultat permet de déduire grossièrement le niveau d’expression du gène en comparaison à un contrôle.

qui suis-je

Answer 25

RT-PCR

Question 26

Quantitatif. Utilisation d’un marqueur fluorescent permettant de suivre le niveau d’amplification de l’ADN en temps réel de manière beaucoup plus précise. elle est aussi nommée REAL-TIME PCR

qui suis-je

Answer 26

qPCR

Question 27

comment le SARS-CoV2 est détectée

Answer 27

, il s’agit d’un virus à ARN. Il faudra donc s’assurer de rétrotranscrire l’ADN viral potentiel pour effectuer le test. De plus, pour obtenir des résultats précis, la technique real-time PCR est généralement utilisée : ceci permet d’avoir une idée de la quantité de matériel génétique virale
initiale retrouvée chez le patient en mesurant le nombre de cycles nécessaires pour obtenir un certain
niveau de fluorescence. La mention “positif” au test dépend d’un niveau minimal obtenu,

Question 28

il existe plusieurs variantes d’un même gène dans une population d’individus (ex. Aa). En amplifiant le gène d’intérêt et en le séquençant, il est possible d’identifier quel allèle particulier porte un individu donné.

qui suis-je?

Answer 28

identification de polymorphismes (allèle)

Question 29

À quoi peut servir l’identification de polymorphisme (4)

Answer 29

1) identifier criminel en comparant séquence trouvée sur scène de crime et séquence d’un suspect (injection d’amorces des 2 allèles)

2)test de paternité (injection d’amorces des 2 allèles)

3) diagnostif d’infections (injection d’amorces de gènes viraux et bactériens)

4)diagnostifs prénataux (séquence cible amplifié pour détecter maladies héréditaires/ anomalie chromosomiques)

Question 30

je suis une forme de PCR, le matériel amplifié est soumis aux agents mutagènes, cloné dans des vecteurs plasmidiques et réintroduit dans un organisme

Answer 30

mutagenèse

Question 31

qu’est qu’une mutagenèse dirigée, soit variante plus spécifique?

Answer 31

les amorces sont porteurs de la mutations

Question 32

qu’Est une mutagenèse variante, aussi nommée création d’OGM

Answer 32

la séquence d’un organisme est amplifiée pour etre injecté dans un autre organisme suite aux clonages dans les vecteurs plasmidiques (

Question 33

comment se forme une sonde

Answer 33

dUTP (se lie avec le ATP portant un P radioactif) est une sonde portant un phosphate radioactif marqué par DIG(stéroïde végétal) qui porte un anticorps associé à une enzyme AP produisant couleur .

Question 34

à quoi sert la fabrication de sonde et comment elles sont produites?

Answer 34

: les sondes peuvent être produites par PCR
ou avec des vecteurs de propagation.

L’ajout de nucléotides marqués à l’aide de molécules/atomes que l’on peut facilement
détecter (ex. 32P, du phosphate radioactif présent dans le phosphate α de l’ATP) dans les réactifs de la PCR permet d’obtenir une sonde facilement traçable (suivable, observable).