Altklausuren Flashcards
a) Cross peaks in 2D-NOESY experiments reflect short distances in space between respective protons. The origin of the cross-peaks lies in mutual, so-called cross-relaxation. Do you know of another mechanism leading to cross-peaks in NOESY spectra? What is it, and which information can be obtained from corresponding cross-peaks?
b) Which molecular property is essential for dipolar relaxation to occur?
c) How does this property reflect on 1H-NMR signal line-shapes and on the sign of the Nuclear Overhauser effect?
a) chemical exchange, exchange rates (kinetics)
b) Molecular tumbling, i.e., rotational motion
c) large molecules (slow tumbling): broad lines, negative NOEs
small molecules (fast tumbling): sharp lines, positive NOEs
Erklären Sie, weshalb die Aminosäurereste Ala und Fly besonders leicht in einem COSY-Spektrum zu identifizieren sind. Wieso sind Prolinreste schwerer zu identifizieren?
Prolin = haben KEINE Backbone-NHs, was Probleme bei der Zuordnung macht
Aladin und Glycin sind recht einfach aufgebaut (und klein), weshalb eine Zuordnung einfacher ist. Jedes der Kohlenstoffatome hat einen anderen Liganden/ein anderes Atom gebunden, was die Analyse vereinfacht.
Skizzieren Sie, wie Sie prinzipiell durch Überlagerung eines TOCSY- und eines NOESY-Spektrums zu einer sequentiellen Zuordnung des Peptidrückgrates gelangen.
Im selektiven 1D TOCSY erscheinen alle Protonen eines Spinsystems, wenn die verwendete Mischzeit lang genug gewählt war. Hier erfolgt die Phrasierung aller Signale positiv. Mit Hilfe des selektiven 1D NOESY kann man nun die Methylgruppen zuordnen, die der Anregungsstelle benachbart ist. Im NOESY Experiment treten die Kerstins über bipolare Kopplung in Wechselwirkung. -> Das NOESY Experiment ermöglicht es, getrennte Spinsysteme, zwischen denen die skalier Kopplung zu klein für TOCSY-Transfer ist, zu verbinden. Der Transfer durch NOE zwischen zwei Spins ist proportional zu r^6 und wird zur präzisen Bestimmung relativer intermolekularer Entfernungen in der Struktur- und Konformationsaufklärung großer und kleiner Moleküle verwendet.
Da das TOCSY bzw. ein Transfer via Protonenkopplung bei größeren Proteinen nicht mehr funktioniert/ineffizient wird, muss man dementsprechend auf Techniken zurückgreifen, die auf Kopplung zwischen Heterogenen beruht.
Erläutern Sie die Wirkung eines Gradientenpulses und schildern Sie knapp, wie sich Diffusionsgeschwindigkeiten mit Hilfe eines Gradientenechos messen lassen.
Gradientenpuls: add to the B0 field in a space dependent manner
-> encode a specially chemical shift
-> can be refocussed by a gradient echo
Gradient echo:
- a pair of matched gradient pulses encodes the spins for displacement
- coheent motion preserves the signal amplitude, but leads to a phase shift
- random motion results in an attenuation of the signal amplitude
Ein 1H NMR Spektrum wurde mit einer digitalen Auflösung von 2 Hz/Punkt aufgenommen. Können Sie in diesem Spektrum eine Kopplungskonstante von 1 Hz oder kleiner messen? Begründen Sie Ihre Aussage knapp.
digitale Auflösung von 2 Hz/Punkt reicht NICHT für eine Kopplungskonstante von 1 HZ oder kleiner
-> die digitale Auflösung ist wichtig für die Feinstruktur des Spektrums und sollte kleiner als die Peakbreite sein, damit der Peak ausreichend dargestellt werden kann. Digitale Auflösung bezeichnet dabei das Frequenzintervall zwischen den einzelnen Datnepunkten (Rd=1/At). Eine verbesserte Auflösung erreicht man beispielsweise durch Erhöhung der Aufnahmedauer (At), was allerdings nicht immer sinnvoll ist, da der FID exponentiell abfällt, und bei einer Verlängerung der Aufnahme kein Signal mehr aufgezeichnet wird.
Sie erhöhen bei einem 1H NMR Experiment die Anzahl der Scans um den Faktor 4. Wie groß ist die Verbesserung des Signal/Rausch Verhältnisses?
Signal-Rausch-Verhältnis
-> Scanzahl (ns) einstellen
Das Signal/Rauschen im Spektrum steigt mit ns, der Zahl der Akkumulationen
SR = k * Wurzel aus (ns)
d.h. das Signal/Rauschverhältnis verdoppelt sich bei der vierfachen Messzeit. Die kleinsten Signale bestimmen ns
S(t) -> FT -> S(w)
Vergleichen Sie die COSY und die NOESY Pulssequenzen. Schildern Sie möglichst knapp, wie Kreuzsignale in den beiden Experimenten entstehen.
NOESY: während kaum kommt es zur Entstehung der Cross Peaks, da es zu einem Polarisationstransfer dipolar koppelnder Kerne kommt
COSY: Signale, die in den beiden Dimensionen mit unterschiedlichen chemischen Verschiebungen “markiert” worden sind
-> Transfer von Magnestisierung
Entsteht durch die “Mischzeit” (einfacher 90° Puls)
Warum nehmen Sie zur Zuordnung von 1H NMR Spektren von Peptiden ein DQF COSY und kein “normales” COSY-Spektrum auf?
Bei einem “normalen” COSY kommt es zu sogenannten “line-shape” Problem (Satelliten), durch einen weiteren 90°-Puls kommt es dazu, dass nur noch Signale aus einer double-quantum, coherence sichtbare Signale liefern und diagonal peaks von “uncoupled nuclei” werden eliminiert.
Erklären Sie anhand einer z.B. Sinusschwingung was die “Dwell Time” (DW) ist. In welchem Zusammenhand stehen DW und die spektrale Weite (SW)?
For a sine wave to be adequately digitized as it decays in time (such as a FID in NMR), the number of points (NP) used in the acquisition has to be equal twice the total number of cycles observed.
NP = 2(#cycles)
NP/sec = 2(#cycles/sec)
In NMR, the dwell time, DW is defined as the number of seconds between points during data acquisition in the FID, which is the same as seconds/point such that
DW=sec/NP
1/DW=NP/sec=2(#cycles/sec)
The total number of cycles per sec is the same as the total window of observed Hz, and is called the spectral width, SW
1/DW = NP/sec = 2SW
Skizzieren Sie den Ablauf eines 2D NMR Experimentes und erklären Sie dabei die Phasen “Preparation”, “Evolution”, “Mixing” und “Detection”
1) Preparation 2) Evolution (t1) 3) mixing time (tM) 4) Preparation (t2)
The preparation time: Upon the preparation time the spin system under study is firstly prepared, for example it is submitted either to a decoupling experiment or just a transverse magnetization by the means of a 90° impulsion. It allows the excited nuclei to get back to their equilibrium state between two successively executed pule sequence.
The evolution time t1: During the evolution time t1, the spin system is evolving under the effect of different factors, each coherence evolves at its own characteristic frequency as a function of the chemical shift and of the scalar coupling of the corresponding nucleus.
The mixing time: It is made of a pulse sequence wich achieves coherence transfers in such a way that different frequencies can be correlated.
The detection time: The acqusition of the modulated signal takes place during the detection period
Warum wählen Sie H2O und nicht D2O als Lösungsmittel bei NMR spektroskopischen Untersuchungen von Peptiden, und warum stellen Sie im Regelfall einen sauren pH-Wert ein?
Bei einem sauren pH sind die Peptide im protonierten Zustand (stability reasons/slower exchange)
Benutzung von INEPT bei HSQC
Der INEPT Transfer erlaubt die Verknüpfung zweier Kerne durch deren skalare Kopplung ist es möglich; Spektren zu erzeugen, in denen die chemische Verschiebung von zwei Kenen miteinander korreliert sind. Man nutzt dabei in den meisten Fällen die 1J skalare Kopplung aus, diese besitzt den Vorteil, dass sie erstens groß und zweitens kaum von der chemischen Umgebung btw. einer Konfirmation abhängen (die 1JNH Kopplung im Pepita- oder Proteinrückgrat liegt beispielsweise immer bei etwa 90 Hz). So ist es möglich, eine Dauer für den INEPT Transfer zu wählen, sodass die Transfereffizienz für alle zu beobachteten 1J Kopplungen etwa gleich ist.
Explain (briefly!) why the gradients Gz dephase the water signal while desired signals are recovered.
Der Puls ist sehr lang und schwach -> dadurch ist er sehr selektiv
The HMBC spectrum of L-threonine was acquired without decoupling. In this spectrum the directly attached 13C leads to a doublet whereas the long-range couplings do not. Why do we see the doublet only for the short-range 1JCH signal?
a) The compound was isotopically labelled with 13C
b) The doublets lead to weak peaks for long-range couplings
c) Thereisnocouplingforlong-rangeconnections
d) The long-range couplings are too small to be resolved
e) A JCC coupling between adjacent 13C-atoms develops
d) The long-range couplings are too small to be resolved
The HMBC lacks the last interval of the HMQC. In order to get in-phase lines we used a magnitude calculation sqrt(RE2+IM2). If the phase is preserved the lines will look complex showing the expected anti-phase structure. What happens if one uses decoupling during acquisition?
a) Decoupling will have the effect to show in phase doublets
b) Decoupling will null the overall signal
c) Bothcomponentsbecomepositive
d) An NOE develops causing a signal enmhancement
b) Decoupling will null the overall signal
