Altklausuren Flashcards
Nennen Sie drei Quellen von Hintergrund in einem Fluoreszenzexperiment und charakterisieren Sie diese bezüglich der Wellenlänge und des Zeitverhaltens!
- Rayleigh-Streuung/scattering -> lambda H = lambda laser -> instantaneous
- Ramon-Streuung/scattering -> lambda kanal > lambda laser -> instantaneous
- Hintergrund-Fluoreszenz -> lambda Fl > lambda laser
- Background fluorescence -> delayed
Benennen Sie zwei Quellen für Hintergrundsignal bei Einzelmolekülfluoreszenzexperimenten: Eine die von der Laserintensitöt abhängt und eine, die unabhängig vom Laser ist. Erläutern Sie eine Möglichkeit zur Reduktion des laserinduzierten Hintergrundes!
1) Rayleigh scattering -> appropriate
- spectral filter (same wavelength as laser)
- temporal filter (immediate response to laser)
1) detector dark counts signal
a) Benennen Sie die Aminosäure, die typischerweise zur spezifischen Markierung von Proteinen verwendet wird!
b) Zählen Sie für den Fall, dass ein Protein an zwei Stellen mit einem Donor bzw. Akzeptor nach dem Zufallprinzip markiert wird, die vier möglichen Marker-Positionen auf!
c) Benennen Sie von diesen vier diejenigen Kombination, die für die FRET-Experimente am problematischsten ist,
d) und erläutern Sie, wie in einem Einzelmolekül-FRET-Experiment in diesem Fall die ungünstig markierten Proteine aussortiert werden können!
a) Cysteine
b) Pos 1 DDAA
Pos 2 DADA
c) D-D
d) additional or alternative (pulsed) direct acceptor
excitation to check for acceptor presence
Nennen Sie die Größe, die bei der Calibration einer optischen Pinzette bestimmt wird!
spring constant (stiffness)
Nennen Sie zwei Mikroskopie-Techniken, die zur Einzelmolekül-Fluoreszenz-Messung eingesetzt werden können! Nennen Sie jeweils einen Vor- und einen Nachteil!
- TIRF microscopy
PRO: parallel detection
CON: measurement deep into cell/solution not possible - confocal microscopy
PRO: can measure deep inside cells
CON: no parallel detection
Benennen Sie jeweils geeignete Mikroskopiemethoden für Einzelmolekülexperimente a) in Lösung und b) ummobilisiert! Begründen Sie Ihre Entscheidung! Von welchen Komponenten des Mikroskops hängt das Signal/Rausch-Verhältnis entscheidend ab?
a) solution: confocal microscope
-> good imaging quality in solution, suppression
-> of out-of-focus fluorescence
b) immobilized: TIRF microscope
-> parallel observation, more molecules per time
-> suppression of fluorescence from solution
signal-to-noise depends on:
- filters
- detectors
- objective
Benennen Sie die Aminosäure, die typischerweise zur spezifischen Fluoreszenzmarkierung von Proteinen für die Einzelmolekülspektroskopie verwendet wird! Benennen Sie die beiden Farbstoffklassen , die am häufigsten für Einzelmolekülfluoreszenz genutzt werden! Benennen Sie einen Prozess, der zu laserinduzierten Hintergrund führt, und charakterisieren Sie diesen spektral und zeitlich?
- Cysteine
- Rhodamines
- Carbocyanines
- Roman Scattering -> red shifted to excitation, instantaneous
a) Ein Vorteil der Einzelmolekülmikroskopie ist die Möglichkeit, in einem Ensemble Heterogenität zu messen. Erklären Sie den Unterschied zwischen einer dynamischen einer statischen Heterogenität.
b) Nennen Sie einen weiteren Vorteil der Einzekmolekülspektroskopie.
a) static heterogeneity -> at a given time, different molecules behave differently
dynamic heterogeneity -> one molecules is changing its behavior with proceeding time
b) kinetics can be measured under equilibrium conditions
a) Nennen Sie zwei Größen, die zur Bestimmung des Försterradius eines FRET-Farbstoffpaares bekannt sein müssen.
b) Angenommen, ein Protein ist mit einem FRET-Paar markiert und Donor und Akzeptor können sich aufgrund steirischer Einschränkung nicht frei bewegen. Wie kann man dies experimentell nachgewiesen werden? Welche Größe/welcher Parameter muss dann genauer betrachtet werden? Erläutern Sie dessen Einfluss auf die Transfereffizienz zwischen Donor und Akzeptor.
a) Emission spectrum of the donor
Absorption spectrum of the acceptor
b) can be verified with (time resolved) anisotropy
In this case, the orientation factor kappa^2 needs to examined.
If the oscillating electrical field of the donor is perpendicular to the dipole axis of the acceptor, kappa^2 = 0, no transfer, transfer efficiency as at its maximum for parallel orientation of donor E-field and acceptor dipole
Erläutern Sie drei Möglichkeiten, Proteine für die Einzelmolekülspektroskopie zu immobilisieren.
- Protein with a His-tag -> cover slip functionalized with Ni-chelating group
- small (50 nm) vesicles -> immobilized with biotinylated lipids and streptavidin
- gel embedding -> gel (like agarose) with small pore size
Eigenschaften von Mikroskopiemethoden (confocal, TIRF and wide field)
- Confocal: immobilized molecules and freely diffusing molecules
- TIRF: immobilized molecules
- widefield: immobilized molecules
Nennen Sie die beiden am häufigsten eingesetzten Gruppen von Farbstoffmolekülen! Welche unvorteilhafte Eigenschaft hat eine der beiden Gruppen?
- Rhodamines
- Cyanines: Photo isomerization is causing dark states
a) Welche beiden Streuprozesse sind die Ursache für laserinduzierten Hintergrund in einem Einzelmolekül-Fluoreszenzexperiment?
b) Charakterisieren Sie jeweils das spektrale Verhalten (bzgl. Anregung) der beiden Streuprozesse.
c) Charakterisieren Sie das Zeitverhalten der Streuung.
- Rayleigh: same wavelength
- Raman: redshifted
- instantenous
a) Welche Größe des Mediums, in dem sich das FRET-Paar befindet, hat Einfluss auf den Försterradius eines FRET-Paares?
b) Angenommen, ein Protein ist mit einem FRET-Paar markiert und Donor und Akzeptor können sich aufgrund steirischer Einschränkungen nicht frei bewegen.
a) Wie kann dies experimentell nachgewiesen werden?
b) Welcher Parameter zur Ermittlung des Försterradius wird von der Beweglichkeit beeinflusst? Welchen Wert nimmt dieser Parameter an, wenn die Farbstoffe am Protein frei beweglich sind?
a) refractive index
b) Anisotropy measurement
Orientation factor
0 «_space;kappa^2 >= 4
Average 2/3
Was kann der Grund dafür sein, dass in einem Einzelmolekül-FRET-Experiment die beiden Kreuzkorrelationen gDA und gAD voneinander abweichen?
acceptor photo bleaching during transit or 3 states with cycling
