ADN recombinant Flashcards
Qu’est-ce que la méthode de l’ADN recombinant ?
Induction de sécrétion d’un produit à partir d’un système
génétiquement modifié par expression d’un gène étranger
(Boyer et Cohen, 1973).
Quelles sont les étapes ?
Étapes :
o Insertion d’un gène d’intérêt dans un plasmide (ADN
circulaire) : formation d’un ADN recombinant
→ ou on peut le produire dans un bactériophage.
o Introduction dans le génome de bactéries par transfection.
o Multiplication des bactéries.
o Culture des bactéries : induction de la production de la
protéine.
o Lyse des cellules.
o Extraction, purification de la protéine.
- Combinaison d’ADN venant de 2 organismes différents
- Objectif : Isoler des fragments d’ADN de génomes complexes et
les recombiner dans des génomes plus petits et faciles à manipuler
et à analyser. - Produits obtenus par l’ADN recombinant : souvent des
protéines issues de gènes introduits dans des micro-organismes
(enzymes, hormones peptidiques, vaccins recombinants…) - Intérêts des protéines recombinantes : source non limitée, plus
pure, production de protéines modifiées plus facilement…
Exemple de l’insuline :
Grâce à cette méthode de l’ADN recombinant, on a pu produire des
protéines modifiées.
Certaines personnes sont insulinodépendant (diabète), ils
possèdent de l’insuline rapide et de l’insuline retard (insuline retardée dans la distribution).
Lors d’un pic d’hyperglycémie, ils produisent de l’insuline rapide. Ces patients s’injectent le matin de
l’insuline lente (= distribution lente). Ceci à été rendu possible grâce à la méthode de l’ADN recombinant.
Pourquoi faire de l’ADN recombinant ?
Les gènes venant de génomes complexes ne pouvaient pas être utilisés. On a donc essayé de l’isoler, le
faire insérer dans un plasmide et le faire reproduire dans un génome plus facilement manipulable.
Quels sont les principes de production de protéines recombinantes ?
1ère étape : Extraction du gène d’intérêt à partir du génome de l’organisme « donneur » (ex: une
cellule humaine).
2ème étape : Transfert du gène d’intérêt dans le génome de l’organisme « receveur ».
Nécessite aussi :
- un système d’induction
- un système d’amplification
- un vecteur d’expression
- un marqueur de sélection (pour savoir quels sont les clones qui possèdent bien le plasmide
recombinant)
- une stratégie d’extraction et de purification
Principe :
- Après introduction du gène d’intérêt dans la bactérie, un système d’induction se met en route, ce
qui active le promoteur qui permet la multiplication cellulaire et donc l’amplification du gène.
- Le vecteur d’expression prend ensuite le relais pour produire la protéine recombinante et
l’incorporer.
- Il faut ensuite s’assurer (avant de démarrer la mise en culture) que l’ADN recombinant qui est
porté par le vecteur d’expression soit bien intégré dans le génome de la bactérie. Pour cela, on
utilise les marqueurs de sélection.
Quels sont les vecteurs de l’ADN recombinant ?
Ils vont permettre l’amplification de l’ADN fragment : plasmides (+fréquent) ou bactériophages (ce sont
des vecteurs procaryotes) dans lesquels on insère le fragment de l’ADN.
Ces vecteurs sont différents selon les cellules dans lesquelles on va pouvoir les transférer : soit des
eucaryotes, soit des procaryotes.
Plasmides :
- Petit ADN circulaire contenu dans bactéries
- Peuvent insérer des fragments de 1 à 5 K Bases (si le gène d’intérêt est plus gros, on utilise les
bactériophages), un des plus connu est le pUC18
- Séquence promoteur : reconnue par ARN polymérase (lac Z ou GAL10 codent pour une
β-galactosidase qui permet de cliver des composés)
- Origine de réplication
- Marqueur de sélection (ampR = ampicilline, indiquant une résistance à l’ampicilline)
- Sites pour enzymes de restriction (SMC) (Polylinker) : les enzymes de restriction reconnaissent des
séquences bien particulières et les coupent. C’est ici que sera inséré le morceau d’ADN.
Il faut donc au final :
- Une origine de réplication (ORI)
- Un gène d’intérêt
- Des sites à enzyme de restriction
LacZ code pour β-galactosidase.
Lacl code pour facteur contrôlant transcription de lacZ.
MCS site multiple de clonage
Si on insère un fragment sur la séquence LacZ’ (violet), cela va couper le sens de lecture et la
β-galactosidase ne sera pas exprimée. Alors les clones qui ont reçu l’ADN recombinant ne pourront pas
exprimer la β-galactosidase.
Bactériophages : Pour insérer des fragments de 10-20 Kb contre
5-10 Kb pour les plasmides
Ce sont des organismes(virus) qui vont attaquer notamment des
bactéries, ils vont infecter l’hôte pour ensuite utiliser leur
machinerie pour repliquer leur ADN. On va utliser cette capacité à
insérer leur ADN dans un hôte pour pouvoir insérer un gène
d’intérêt.
Ils vont insérer des fragments de 10-20kb.
On va les utiliser en tant que vecteurs mais en diminuant leur
pathogénicité par l’élimination de fragments génétiques
responsables de la lyse cellulaire ou par d’autres mécanismes
pathogéniques.
Un peu plus délicat à utiliser mais se fait pour les gros fragments.
DNA : Multiple-length bacteriophage lambda DNA
On voit la tête du bactériophage avec un ADN linéaire dont on connaît la séquence. Une fois que l’ADN
est bien retrouvé dans la tête, ils vont développer des protéines pour développer leur queue, qui va
pouvoir s’insérer au niveau de la cellule et délivrer leur ADN.
Quelles sont les étapes de clonage par plasmides ?
a- Extraction d’un gène d’intérêt
On a l’ADN étranger et le plasmide circulaire, grâce à des endonucléases (enzymes de restrictions) on
va pouvoir couper une partie du plasmide et une partie de l’ADN étranger. Puis on va permettre d’insérer
cette partie d’intérêt dans le plasmide et grâce à des ligases on va lier et reformer l’ADN recombinant.
Enzymes de restriction :
● 1
ers
instruments pour manipuler le patrimoine génétique
(1970)
● Ce sont des moyens de défense bactérien pour lutter
contre les virus ( elles coupent à certains endroit le virus)
● Elles sont spécifiques de séquences palindromiques (= ça
se lis dans les deux sens) (ils coupent à ce niveau-là et les
extrémités des fragments coupés sont ensuite liés par une
ligase)
Par exemple on a Alu1, qui va reconnaitre les séquences
palindromiques AG/CT et qui va pouvoir reconnaître ces
séquences et ensuite les couper (de façon franche ou
dissymétrique) , créer des extrémités cohésives ( compatible
entre elles) qui vont pouvoir s’apparier et être reliées par la ligase.
Cette ligase va relier les deux parties pour créer un ADN recombinant / recombiné ⇒ création de l’ADN
chimérique qu’on va essayer de répliquer.
EcoR1, qui reconnaît la séquence G/AATTC, qui va couper entre le G et l’AATTC, ensuite crée des
extrémités cohésives dans lesquelles on va
pouvoir insérer le gène d’intérêt et ensuite
les relier par un lisage.
On nomme ces enzymes d’une certaine
manière :
● 1ère lettre en majuscule : genre du
micro organisme dans lequel elle a
été isolée
● les 2 lettres suivantes: nom de
l’espèce
● à la fin: chiffre romain correspondant
au nombre d’enzymes de restriction
qu’on a isolé de cette espèce
Les plus courantes sont EcoR1 et EcoRV.
b- Transfection
Explication du schéma: on coupe l’ADN, on l’insère et on relie et on introduit cet ADN recombinant dans
les cellules, donc les transfecter. Ensuite on va cloner, on va faire du criblage, les multiplier et on va
induire l’expression de la protéine.
Pour la transfection, il y a différentes méthodes: soit on utilise le phosphate de calcium, soit
l’électroporation ou utiliser des réactifs à base de lipides.
Il y a d’autres exemples de méthodes de transfections, ici transfection dans des cellules mammifères,
par exemple en utilisant une affection par des virus eucaryotes. On peut aussi directement insérer dans
les noyaux ou bien par des liposomes.
Ici exemple de transformation de Chlorella par électroporation, pour insérer certaines parties d’ADN, en
utilisant un voltage ( en kV), des pulses précis.
c- Criblage
1ère méthode : Pour savoir laquelle a intégré l’ADN recombinant ?
→ Repérage de la colonie contenant le
gène d’intérêt par hybridation d’une
sonde marquée
Nous avons une inoculation de boite de
pétrie par des bactéries qui
normalement contiennent les plasmides
recombinants. On va mettre par-dessus
un papier absorbant pour réaliser un
replicata de ces colonies.
Ensuite sur ce papier absorbant on va
lyser les bactéries grâce à une
dénaturation de l’ADN avec des bases
alcalines.
Puis on réalise une hybridation avec une sonde d’ADN complémentaire et marquée (radioactive). On
va incuber et ensuite laver si elles présentent le plasmide d’intérêt elles vont pouvoir être visible par
autoradiographie.
Comme ceci on va pouvoir savoir quelles sont les colonies de bactéries qui ont le plasmide d’intérêt.
Sur le schéma ci-dessus on voit que 2 colonies présentent le produit d’intérêt, on sélectionne donc ces
bactéries et on les met en culture et on sait que lorsque l’on aura induction de production de protéine on
va pouvoir avoir cette protéine qui est ensuite plus ou moins purifiée.
2ème méthode : (plus utilisé)
Exemple avec le plasmide pUC18 (plasmide of university of california):
Il contient un opéron LacZ (= séquence promoteur) qui code pour β-galactosidase (coupe le lactose),
avec un polylinker (=site pour les enzymes de restriction, les polinkers sont des fragments d’ADN quisont synthétisés dans lequel il y a plusieurs sites de restriction unique)
inséré au niveau de l’opéron de la β-galactosidase, c’est l’opéron de
lactose, et une séquence ampicilline résistante.
Un petit fragment du gène d’intérêt va être inséré dans le polylinker donc
quand il y a un gène d’intérêt, la β-galactosidase ne va pas s’exprimer.
On va faire pousser notre colonie bactérienne sur une boîte de pétrie qui
contient dans sa gélose de l’ampicilline et du X-gal qui est blanc.
Lorsque la β-galactosidase est présente, elle va lyser la partie sucre du
X-gal ce qui va permettre de libérer le β-galactose et le dérivé
5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindol qui est bleu (l’addition des 2 forme le
X-gal).
Quand les bactéries se développent dans cette bactérie, si elles ont
intégré le gène du plasmide, elles vont se développer. Si on a réussi à
insérer le fragment dans le plasmide, alors on a un gène qui empêche la
β-galactosidase de s’exprimer donc elle ne coupe plus le X-gal en
composé bleu. Le X-gal reste donc blanc (c’est ce que l’on recherche). On
multiplie ces bactéries (mise en culture).
Attention : Si ça reste bleu, on a pas réussi l’expérience.
Lorsque nous avons des colonies qui n’ont pas inséré dans leur génome le
plasmide d’intérêt, elles vont rester bleues alors que celles qui ont inséré dans leur
plasmide le gène d’intérêt vont être blanches.
d- Multiplication et induction
1er criblage : Celles qui vont pousser c’est celles qui vont avoir un plasmide présent car il peut y avoir
des bactéries dans lesquels on a pas réussi à insérer un plasmide et ne vont pas être résistantes à
l’ampicilline et donc ne vont pas pousser sur ce milieu de culture contenant l’ampicilline.
2ème criblage : Pour bien choisir les colonies bactériennes qui possèdent un ADN recombinant il faut
se baser sur la coloration.
Pourquoi les colonies qui ont inséré un plasmide original sans qu’il soit recombinant vont rester bleues ?
Et pourquoi les autres vont rester blanches ?
Parce que lorsque la β-galactosidase est exprimée elle va pouvoir libérer le 5-bromo-4-chloro-3-hydroxy
indol (bleu)
Explication : Lorsque l’on a un ADN recombinant, le polynucléaire est présent dans le plasmide donc les
enzymes de restriction vont couper cette partie présentant le polynucléaire, on aura donc introduction du
gène b à cet endroit et donc l’opéron lac Z ne va pas pouvoir s’exprimer et la β-galactosidase ne va pas
non plus être exprimée et donc les colonies vont rester blanches.
On lie l’insert et le vecteur par des ligases pour obtenir l’ADN recombinant qu’on transfecte dans la
cellule hôte, on les clone et on sélectionne le clone (bactérie, souche) qui contient le fragment d’intérêt
soit par autoradiographie soit par production d’une coloration bleue ou non.
Ensuite on multiplie, on met en culture les bactéries qu’on aura sélectionnées ce qui va induire la
production de l’antibiotique ou de l’insuline. Ensuite on va pouvoir lyser et purifier.
Quelles sont les étapes de clonages dans un bactériophage λ ?
(C’est moins utilisé que les plasmides)
Infection d’une cellule bactérienne :
● Accolement de la queue à la paroi cellulaire
● Transfert d’ADN dans la bactérie
● Transcription des gènes du phage par l’ARN polymérase
bactérien
● Traduction de l’ARNm correspondant
● Nouvelle réplication de l’ADN du phage et liaison
spontanée des protéines « tête » et « queue »
● Lyse des bactéries hôtes pour obtenir la protéine d’intérêt
après purification
Une fois qu’on a construit ce bactériophage qui à l’ADN
recombinant, on va le mettre dans une bactérie hôte pour obtenir
les protéines d’intérêt.
Pour les systèmes d’expression de protéines voir le cours directement (tableau)
voir à la fin de la page 7
Quelles sont les étapes de production des protéines recombinantes ?
1- Scale-up
2- Downstream process
La lyse (qui est nécessaire lorsque les protéines sont intracellulaires) permet de récupérer ces produits
d’intérêt. Elle peut être faite de différentes manières :
De façon mécanique :
● Gel/dégel
● Homogénéisation
● Pression ou sonication (la sonication est plutôt utilisée pour les petits volumes)
De façon chimique :
● Bases
● Détergents
● Solvants organiques (ex : méthanol peut lyser les cellules.
De façon enzymatique pour dégrader la paroi des bactéries et des levures notamment (moins utilisée) :
● Lysozymes qui vont pouvoir détruire la paroi des bactéries Gram +
● Lysozyme + EDTA pour la lyse de la paroi des bactéries Gram –
● Combinaisons d’enzymes particulières selon la composition de la paroi que l’on veut détruire :
-1,3-glucanase, -1,6-glucanase, chitinase, mannases…
La purification = Downstream process :
On peut utiliser différentes méthodes :
● Clarification : centrifugation ou microfiltration
● Précipitation : on utilise des sels et solvants organiques (les protéines salifiées restent en phase
aqueuse)
● Concentration : ultrafiltration ou sous/vide (à l’échelle d’un laboratoire, on utilise la concentration
sous vide et en industrie, on utilise l’ultrafiltration).
● Séparation chromatographique :
o Chromatographie d’affinité
o Chromatographie échangeuses d’ion
o Chromatographie par gel filtration
Donner des exemples de biothérapies
Les produits biologiques peuvent se diviser en :
● Produits non issus de l’ADN recombinant (vaccins, toxines et antibiotiques, enzymes, hormones,
anticorps polyclonaux, médicaments dérivés du sang, thérapies cellulaires et tissulaires…).
● Produits issus de l’ADN recombinant :
● Les dérivés d’acides nucléiques comme les oligonucléotides et plasmides, les vaccins
à ADN, les thérapies géniques.
● Les protéines recombinantes comme les protéines thérapeutiques, les anticorps
monoclonaux et les vaccins recombinants et thérapeutiques.
o Les protéines thérapeutiques peuvent être des facteurs de croissance,
hormones, cytokines, enzymes ou facteurs plasmatiques.
Donner des exemples de médicaments (protéines) issus de l’ADN recombinant
- Insuline -> E. coli -> diabète
- IL2 -> E.coli -> cancer/immunostimulant
- Interférons -> E.coli/levure -> cancer/Traitement d’infections virales
- Prourokinase -> E.coli/levure -> anticoagulant/crises cardiaques
- CSF -> E.coli/levure -> immunostimulant
CSF = facteur de stimulation des colonies
Donner des exemples de biomédicaments (protéines) produits par
ADN recombinant
A- Protéines thérapeutiques
1- Insuline
a- Histoire
1920 : Découverte de l’insuline par Frederick Banting et Charles Best.
Ils avaient prélevé et utilisé des isolats de pancréas de chiens pour traiter un enfant : c’est la découverte
de l’activité hypoglycémiante et de l’utilisation possible de l’insuline dans le traitement du diabète.
1922 (Novembre) : Production d’insuline par Eli Lilly et Company.
1923 : MacLeod et Banting reçoivent conjointement le Prix Nobel de Physiologie et de Médecine « pour
la découverte de l’insuline ».
1964 : Dorothy Crowfoot Hodgkin reçoit le Prix Nobel de Chimie pour la détermination de la
conformation spatiale de l’insuline.
1980 : Frederick Sanger reçoit le Prix Nobel de Chimie pour la détermination de la composition en
acides aminés de cette hormone.
b- Origine et structure
L’insuline est une hormone polypeptidique. Elle est produite par les cellules bêta β des îlots de
Langerhans (pancréas endocrine).
Elle a un rôle dans la régulation des carbohydrates, protéines et acides gras. En effet, elle augmente la
captation du glucose par les cellules adipeuses et musculaires, entraînant une baisse de la glycolyse et
de la néoglucogenèse. Elle augmente le métabolisme des lipides et de la synthèse protéique. Elle a
donc un effet hypoglycémiant.
S’il y a déficience de synthèse d’insuline, cela entraîne le diabète (Diabetes mellitus). Le traitement de
ce diabète correspond à une injection journalière en sous cutané d’insuline.
c- Structure ( les séquences de AA ne sont pas à apprendre par coeur )
L’insuline est composée de deux chaînes
polypeptidiques : la chaîne A de 21 acides
aminés et la chaîne B de 30 acides aminés.
Ces deux chaînes sont reliées par deux ponts
disulfures. Un 3ème pont disulfure est présent
au niveau de la chaîne A. Cette insuline peut
former des complexes de Zinc et une structure
dimère voire de type hexamère.
Il y a une analogie importante entre l’insuline
des mammifères, l’insuline humaine, bovine et
porcine.
Pour l’insuline humaine, il y a, par exemple, en position 8 de la chaîne A (A8) une thréonine, en 10 (A10)
une isoleucine et une thréonine en B30 (chaîne B, position 30).
Les deux autres insulines (bovine et porcine) vont être différentes de l’insuline humaine par un seul
acide aminé pour l’insuline porcine et trois acides aminés pour l’insuline bovine.
L’insuline porcine a une alanine en B30, à la place de la thréonine. L’insuline bovine a une alanine en
A8, une valine en A10 et une alanine en B30
.
d- Biosynthèse de l’insuline
Le précurseur est une pré-pro-insuline qui est formée de 100 résidus d’acides aminés :
● Une 1ère séquence signal a une fonction NH2 terminale de 16 acides aminés,
● Reliée à la chaîne B de 30 acides aminés.
● Il y a une chaîne C de 35 acides aminés, une chaîne A de 21 acides aminés et une fonction
COOH terminale.
Suite au clivage et à la perte du séquence signal, on obtient la pro-insuline après formation de ponts
disulfures entre A et B, et en intra-chaîne au niveau de la chaîne A. Il y a ensuite libération du peptide
C, permettant l’obtention de l’insuline mature.
Propriétés physico-chimiques de l’insuline :
● Instabilité des ponts disulfures.
● Sensibilité à l’acidité et aux protéases (on doit
garder l’insuline dans des conditions basses en
température, au réfrigérateur et à l’abri de la
lumière). Elle ne peut être utilisée que par voie
sous cutanée.
● Solubilité dans l’eau assez bonne (pHi (pH
isoélectrique) = 5,4).
● Forme des complexes avec Zn ou protamine,
permettant le stockage de cette hormone dans du
verre pour une longue période d’action.
À cause de la sensibilité à l’acidité, on ne peut pas
utiliser l’insuline par voie orale car elle serait détruite en milieu gastrique. On l’utilise donc par voie
parentérale, et plus précisément par voie sous-cutanée.
e- Production industrielle
* Insuline porcine et bovine :
À l’origine, on produisait l’insuline de manière industrielle par extraction à partir de pancréas bovin ou
porcin. La méthode était la suivante :
● Le pancréas est macéré dans l’éthanol à 70°, à pH=2 et à une température de 0°C.
● Après la macération, il y a filtration. On
obtient donc un filtrat.
● On ajoute au filtrat du dichlorure de Zinc
(ZnCl2) à pH=5,5.
● Cela fait précipiter l’insuline qui est non
purifiée.
● On y ajoute HCl pour atteindre un pH=3.
● L’insuline devient soluble.
● On fait des précipitations (pHi=5,5) et
redissolutions (pH=3) en jouant sur le pH.
● On obtient donc une première purification.
● Suivent des étapes de cristallisations, de
chromatographie, de dialyse, de
lyophilisation (étape de chromatographie
très poussée).
● On obtient l’insuline purifiée.
Cependant, du fait de certaines différences de séquences au niveau structural (de 1 à 3 acides aminés),
on a remarqué qu’il y avait apparition d’anticorps avec cette insuline monocomposante, dérivée
d’insuline bovine et porcine. Cela pouvait entraîner des micro-angiopathies diabétiques ; de plus, il était
difficile de purifier l’insuline de manière importante, entraînant des problèmes d’éliminations de
contaminants antigéniques. Un autre procédé va donc être développé.
Il faut éviter au maximum les impuretés, qui provoquaient des réaction immunologique à cause de
l’utilisation de l’insuline animale, on a changé de méthode.
* Insulines humaines :
Cet autre procédé de production industrielle est un peu plus efficace : la production d’insulines
humaines.
Par ingénierie génétique, on obtient l’insuline humaine recombinante. Il y a plusieurs procédés :
Genentech (1982), Eli-Lilly et Novo-Nordisk.
On va faire des analogues (ins. Lispro, aspart, glulisine, glargine, detemir) mais on peut également
utiliser la transpeptidation par hémi-synthèse où le but est de modifier un seul acide aminé comme en
B30 où on modifie l’alanine en thréonine.
Différents types d’insulines existants :
● Suspension d’insuline à base de Zn, de complexes de Zn et de protamine : insuline isophane
avec une durée d’action intermédiaire.
● Analogues d’insuline soit rapide (bolus) ou lente.
N.B. : Sont indiqués par les carrés les modifications d’AA.
→ Parmi les analogues d’insuline rapide :
● Humalog° ou Insulin lispro où il y a modification de l’insuline humaine au niveau des deux acides
aminés B28 et B29. Au lieu d’être ProB28 et LysB29, elle sera LysB28 et ProB29, avec inversion
de ces deux acides aminés.
● Insulin aspart : on a remplacé la proline en B28 par l’aspartate.
● Apidra° ou Insulin glulisine qui correspond à une modification en deux endroits : en B29 et B3
(LysB3 GluB29). Ici, la lysine en B29 est remplacée par de la glutamine. En B3, l’asparginine est
remplacée par la lysine.
→ Pour les analogues d’insuline à action lente :
● Lantus° ou Insulin glargine : GlyA21 ArgB31 ArgB32. On a rajouté deux arginines sur la
thréonine
en B30 (en 31 et 32). On a modifié l’asparginine en glycine en A21. Cela ralentit son action, sa
demi-vie d’élimination.
● Levemir° ou Insulin detemir : LysB29 (N-tetradecanoyl) des(B30). Cela correspond à une
élimination de la thréonine en B30 qui est remplacée par une chaîne d’acides gras (dérivé de
l’acide miristique en C14) pour ralongée la demi-vie d’action et permettre une action retardée.
f- Deux stratégies de production industrielle d’insuline humaine
● Stratégie 1 : Procédé de Genentech et Eli-Lilly (développé en 1982).
L’idée est de produire de manière indépendante les deux séquences A et B de l’insuline avant de les
combiner pour avoir l’insuline mature. Un premier plasmide va accepter une séquence A qui va coder
pour la chaîne A, et dans l’autre plasmide on va insérer la séquence correspondant à la chaîne B. Ces
deux plasmides possèdent une résistance à l’ampicilline. On va les transfecter dans des bactéries de
type E. coli. Celles-ci, une fois criblées, vont être clonées/amplifiées. Elles sont ensuite mises en
culture.
Il y aura induction de la production de deux protéines : une protéine correspondant à la fusion de la
Lac-Z avec la chaîne A et l’autre protéine correspondant à la fusion entre la séquence Lac-Z et la chaîne
B. On traite ensuite avec du bromure de cyanure (CNBr) qui va cliver les peptides entre la méthionine
et la phénylalanine. Cela permet de libérer soit la chaîne A soit la chaîne B. Elles vont être mises
ensemble puis sont ensuite purifiées.
Puis on va oxyder les cystéines pour créer les ponts disulfures et ainsi on obtient l’insuline active qui va
être purifiée par chromatographie pour obtenir l’insuline humaine recombinante hautement purifiée. Par
ce procédé on obtient la lispro.
Il faut donc gérer deux systèmes d’expression en parallèle, une étape de purification, une étape de
clivage et une étape d’oxydation. Cela peut être complexe.
● Stratégie 2 : développée par Novo-Nordisk (la + utilisée)
On utilise une séquence nucléotidique précurseur de l’insuline :mini-proinsuline:
Pro-peptide-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21).
La séquence nucléotidique précurseur est recombinée pour former un plasmide recombinant.
On transfecte dans une levure transformée (Saccharomyces cerevisiae).
Après fermentation, on obtient le précurseur d’insuline.
Le précurseur est extrait et purifié.
Puis étape de clivage enzymatique (par la trypsine).
Obtention de l’insuline tronquée (chaîne incomplète B1à 29 aa).
Par transpeptidation (rajout AA) et purification chromatographique (obligatoire à chaque fois), on
obtient par exemple la detemir. Obtention de l’insuline recombinante humaine hautement purifiée.
Ces méthodes vont permettre la modification plus simple de l’insuline.
Stratégie 1 Stratégie 2
2- Hormone de croissance humaine (hGH ou somatropine)
a- Origine et structure
C’est une hormone polypeptidique produite par la glande pituitaire ou hypophyse. Elle a un rôle dans
la croissance (muscles, os). Un défaut de cette hormone va provoquer le nanisme. Une production
inadéquate va provoquer le gigantisme ou l’acromégalie (trop grande production).
C’est une hormone de croissance linéaire de 191 acides aminés. Le précurseur est une pro-GH
constitué de 191 acides aminés et d’un peptide signal de 26 acides aminés, donc au total la pro-GH est
une séquence de 217 acides aminés. Le peptide signal est clivé par le réticulum endoplasmique.
L’hormone de croissance est alors libérée dans le système endomembranaire où elle va subir une
maturation par production de deux ponts disulfures. On peut remarquer qu’il n’y a pas de glycosylation,
ce qui est intéressant pour utiliser E. coli comme système d’expression.
b- Production industrielle de hGH recombinante
Procédé Genentech, exemple de 2 procédés.
Procédé 1 : Met-r-hGH intracytoplasmique
Procédé 2 : r-hGH intracytoplasmique
On utilise un fragment d’ADN humain contenant les gènes pour hGH est composé de 4 types de
séquences :
● 2 séquences non codantes.
● 1 séquence correspondant à un peptide signal.
● 1 séquence correspondant à l’hormone de croissance sans introns.
→ Pour le 1er procédé Genentech :
● On a le fragment d’ADN.
● On clive et élimine le peptide signal grâce à des enzymes de
restriction.
● On récupère le fragment d’ADN correspondant à l’hormone
de croissance sans peptide signal.
● On l’insère dans un vecteur d’expression (un plasmide)
après liaison.
● Il y a ajout d’une séquence initiatrice de méthionine, on relie
l’ensemble.
● On obtient un plasmide qui va être transfecté dans E. coli.
● Il y a amplification, culture pour produire l’hormone de
croissance.
● L’hormone de croissance s’accumule dans l’espace
périplasmique.
Il y a lyse des cellules Puis purification et production de
cette protéine méthionine-r-hGH.
La méthionine empêchait le bon repliement de la protéine et cela
générait des anticorps. Donc à cause de l’apparition d’une
hypersensibilité, il y a eu développement d’un procédé pour obtenir
r-hGH, par une étape supplémentaire de lyse de la méthionine. Il y
a des problèmes de repliement.
Donc le 1er procédé permet d’obtenir la méthionine met-r-hGH de
192 acides aminés et le 2ème procédé permet d’obtenir l’hormone de croissance à 191 acides aminés.
