9. Flashcards
koji su MEHANIZMI POPRAVKA DNA
reverzija oštećenja (ne mješati s reverzijom mutacije!)
• ligacija jednolančanih (i dvolančanih) lomova u DNA
• enzimska monomerizacija pirimidinskih dimera (fotoreaktivacija)
• uklanjanje alkilnih skupina djelovanjem alkiltransferaza
• uklanjanje oštećenja
• bazni ekscizijski popravak
• nukleotidni ekscizijski popravak
• rekombinacijski popravak
• ignoriranje oštećenja
• replikacija oštećene DNA
Obilježja DSB
dvolančani lom (DSB – „double strand break”)
• najopasnije oštećenje u DNA, može uzrokovati smrt stanice
• može rezultirati degradacijom slobodnih krajeva DNA, gubitkom dijela
kromosoma, genetičkom nestabilnošću, pojavom tumora
• može se popraviti preciznom ligacijom (uspostavlja se prvobitni redoslijed
nukleotida)
• potiče genetičku rekombinaciju
• popravlja se genetičkom rekombinacijom
• Homlogna genetička rekombinacija
• nehomologna (ilegitimna) genetička rekombinacija
(NHEJ –„nonhomologous end joining”)
Vrste genetičke informacije
ilegitimna (nehomologna) - NHEJ
„nonhomologous end joining”)
homologna rekombinacija (HR)
GENETIČKA REKOMBINACIJA
• rekombiniranje, preraspoređivanje genetičkog materijala
• preraspoređivanje postojećih sljedova nukleotida
• prijenos genetičke informacije unutar jedne te iste ili
između različitih molekula DNA
• uključuje “prespajanje” (cijepanje starih i nastajanje
novih) fosfodiesterskih veza
homologna DNA
dvije regije DNA su homologne ako imaju identičan ili gotovo identičan
redoslijed nukleotida (homologni kromosomi, sestrinske kromatide, aleli
nekog gena)
• dvije sekvencije su potpuno homologne (identične) ako imaju potpuno isti
slijed nukleotida
homeologna rekombinacija
homeologna rekombinacija – rekombinacija između jako sličnih, ali ne i
identičnih sekvencija
Nužni uvjeti za odvijanje homologne rekombinacije
• homologna DNA (dvije molekule ili regije)
• minimalno 50 do 100 pb potpune homologije (identični redoslijed
nukleotida)
• učestalost HR raste s porastom duljine homologije
• rekombinacijski proteini
• omogućuju fizičko zbližavanje homolognih regija
• omogućuju da rekombinirajuće regije ostaju u fizičkom kontaktu
• omogućuju izmjenu genetičkog materijala
• enzimi koji cijepaju fosfodiesterske vez
Genetička mapa gena
Genetička mapa gena – mapa gena dobivena temeljem genetičke rekombinacije (genetike)
Fizička mapa gena
Fizička mapa gena – stvarna udaljenost između gena/lokusa
Kritični događaji tijekom HR
-izmjena lanaca
-formiranje HS (Holliday junction, HJ)
-migracija HS
-hibridna DNA
-heterodupleksna DNA
-popravak heterodupleksne DNA
-konverzija gena
-razrješenje HS sa ili bez CO
Egzogena DNA u bakteriji-recipijentu
⚫ može se hidrolizirati
⚫ može se cirkularizirati i samostalno replicirati (ako ima ishodište replikacije)
⚫ može rekombinirati i igraditi se u genom bakterije-recipijanta
Faze Homologna rekombinacija u bakteriji E. coli
tri faze
• presinapsa (inicijacija)
• nastanak 3’-jednolančane DNA na koju će se vezati protein
RecA (najvažniji rekombinacijski protein u E.coli)
• sinapsa
• najvažniju ulogu ima protein RecA
• homologno sparivanje i izmjena lanaca
• formiranje Holliday-eve strukture (HS)
• postsinapsa
• širenje hibridne (heterodupleksne) DNA, pomicanjem HS
• razrješenje rekombinacijskog međuprodukta
Presinapsa
• nastanak 3’-jednolančane DNA
• priprema supstrata za protein RecA
• glavnu ulogu ima proteinski kompleks
RecBCD (egzonukleaza V)
• veže se na kraj dsDNA
• helikazna aktivnost (RecB i RecD)
(~1000 pb/min; 2-3 ATP/pb)
• 3’-5’-egzonukleazna aktivnost (RecB)
• RecC prepoznaje x-sekvenciju (chi):
GCTGGTGG
• promjena nukleazne aktivnosti
(RecBCD postaje 5’-3’ egzonukleaza
te nastaje 3’-ssDNA na koju se veže
protein RecA)
Sinapsa
glavnu ulogu ima protein RecA (352 ak)
• centralna uloga u rekombinaciji u E.coli
• DNA ovisna ATPaza
• veže se na ssDNA i dsDNA (1 RecA na 3 pb; u prisustvu ATP)
• izdužuje dsDNA s ~10,5 pb/zavoju (B-DNA) na 18,6 pb/zavoju
• katalizira izmjenu lanaca uz hidrolizu ATP
RecA (352 ak)
• sparuje homologne molekule DNA ako je barem jedna jednolančana ili
ima jednolančanu regiju unutar homologije
• na odgovarajućim supstratima svojom aktivnošću tvori HS
Postsinapsa
RuvABC
• pomicanje HS
• razrješavanje rekombinacijskog međuprodukta presijecanjem HS
• RuvA (vezanje) i RuvB (helikaza)
• pomiču HS i reguliraju širenje hibridne DNA
• RuvC
• endonukleaza koja specifično prepoznaje i presijeca HS
• RecG (helikaza)
• pomiče HS, može djelomično zamijeniti RuvABC
• sudjeluju i drugi proteini
• u rekombinacijske procese uključeno je više od 30 proteina
SOS-odgovor
Omogućava popravak oštećene DNA
• povećava vjerojatnost preživljenja bakterijskih stanica
• uzrokuje pojavu većeg broja mutanata
• Povećava preživljenje i genetičku varijabilnost populacije
SOS odgovor _ neinducirano stanje
Neinducirano stanje (normalana razina oštećenja DNA)
• protein LexA (represor) regulira vlastitu ekspresiju i ekspresiju najmanje 26
gena potrebnih za „reakciju stanice” na oštećenja u molekuli DNA (niska
razina ekspresije lexA, recA i ostalih gena)
SOS odgovor _ inducirano stanje
(povećana razina oštećenja DNA)
• uzrokuje povećanu pojavu jednolnačane DNA u stanici
• protein RecA se veže na jednolančanu DNA te se aktivira njegova
koproteazna aktivnost
• koproteazna aktivnost RecA uzrokuje cijepanje (inaktivaciju) represora LexA
• indukcija ekspresije proteina (UvrA, UvrB, UvrD, SulA, Ssb, RuvA, RuvB,
PolB, RecN, UmuC, UmuD …) potrebnih za odgađenje diobe stanice,
precizni („error-free”) i mutageni („error-prone”) popravak DNA
Protein LexA
represor; 202 aminokiseline
• veže se kao dimer na operatore gena SOS-regulona s različitim
afinitetom (consensus „SOS-box” = 5’TACTGTATATATATACAGTA3’)
što rezultira određenom razinom ekspresije pojedinih gena
Protein RecA
U SOS-odgovoru – nakon vezanja na jednolančanu DNA uzrokuje
cijepanje LexA i time inducira SOS-odgovor; koproteaznom aktivnošću
cijepa i UmuD i neke druge proteine
• Osim toga – neophodan u rekombinacijskom popravku (homologna
rekombinacija)
Replikacija preko oštećenja
translezijske polimeraze (IV i V)
Rekombinacijski popravak (HR)
proteini RecA, RecBCD, RuvA,
RuvB…
Reaktivaciju replikacije omogućava
DNA-polimeraza II
Što rade translezijske polimeraze
eksprimiraju se tijekom SOS-odgovora
omogućavaju replikaciju DNA preko oštećenja
nemaju 3’-5’-egzonukleaznu aktivnost
neprecizne su
DNA-polimeraza IV
(DinB)
⚫ uvodi mutacije pomaka okvira čitanja (-1)
DNA-polimeraza V
sastoji se od UmuC i 2 UmuD’
⚫ uvodi pogrešno sparene baze
