13. Flashcards
transformacija
prijenos DNA bez
posrednika i bez fizičkog
kontakta stanice-donora i
stanice-recipijenta
• primanje DNA iz okoline
transdukcija
prijenos DNA pomoću
bakteriofaga
konjugacija
prijenos DNA fizičkim
kontaktom stanice-donora
i stanice-recipijenta
što su kompetentne stanice
“kompetentne stanice” – stanice koje mogu primiti DNA iz okoline
• prirodna kompetentnost
• inducirana kompetentnost (laboratorijski postupci: CaCl2
,
elektroporacija; genetičko inženjerstvo)
faze transformacije:
vezanje DNA na površinu stanice
• ulazak DNA u stanicu
• stabilizacija egzogene DNA
replikacija kružne DNA i ekspresija gena (plazmidi)
cirkularizacija i samostalna replikacija (linearni fragmenti)
integracija (ugradnja) egzogene DNA u bakterijski kromosom
uključuje genetičku rekombinaciju
vrste transdukcije
opća – prijenos bilo kojeg gena
(nakon litičkog puta)
• specijalizirana – uvijek se prenose isti geni
(indukcijom litičkog puta u lizogenim bakterijama)
eksperiment transdukcije
donorski soj inficirati i lizirati pomoću faga
• nastalim fagima inficirati recipijentni soj
• selekcionirati transduktante
transducirajući fag
sadrži dio DNA bakterije donora
Kako se integrira genom faga u bakterijin
mjesno-specifična rekombinacija između attP i attB
uvjeti za konjugaciju HTG
zahtjeva prisutnost „muških” i „ženskih” stanica
• muške stanice (donori) imaju F-faktor
• ženske stanice (recipijenti) nemaju F-faktor
što je F-faktor
omogućava konjugacijski prijenos DNA -(“fertility factor”
što je F-faktor
plazmid (F-plazmid)
• dvolančana kružna DNA
• može se samostalno replicirati i prenositi iz
stanice-donor u stanicu-recipijent
• ~100 kb (94,5 kb); 1-2 molekule u stanici;
(pravilno se nasljeđuje)
• sadrži
• ishodište replikacije – oriV (RepF1)
• ishodište prijenosa DNA – oriT
• sekvencije kojih ima i u kromosomu E.coli
• insercijske sekvencije (dvije IS3 i jednu IS2)
• transpozon Tn1000
• gene neophodne za konjugacijski prijenos DNA (geni tra)
što sadrži F-faktor
ishodište replikacije – oriV (RepF1)
• ishodište prijenosa DNA – oriT
• sekvencije kojih ima i u kromosomu E.coli
• insercijske sekvencije (dvije IS3 i jednu IS2)
• transpozon Tn1000
• gene neophodne za konjugacijski prijenos DNA (geni tra)
geni tra
gene neophodne za konjugacijski prijenos DNA
~25 gena koji čine 1/3 F-faktora
• uloga:
• sinteza i izgradnja F-pilusa
• kontakt između konjugirajućih stanica
• replikacija F-faktora tijekom prijenosa u stanicu -recipijent
• zbližavanje stanica i prijenos DNA
• inkompatibilnost s površinom drugih muških stanica
R-faktori
R – “resistance”)
• klinički izolati (rezistencija na antibiotike i teške metale (do 9 antibiotika i 3 metala)
F-pilus
sintetiziraju ga samo stanice koje imaju F-faktor (konjugacijski plazmid)
• obično dugačak 2-3 μm
F-pilus nakon ostvarivanja kontakta sa stanicom-recipijent
depolimerizacija i skraćivanje pilusa
• približavanje stanica
• stanice se “stabiliziraju” zahvaljujući proteinima na površini stanica
Konjugacijski prijenos DNA koraci
počinje na oriT (cis-djelujuća sekvencija,
bogata A:T parovima baza, dugačka 100 pb)
• zasijecanje (“nikiranje”, pojava
jednolančanog loma) oriT iza 60og pb
• u stanici-donor – sinteza
komplementarnog (vodećeg) lanca
mehanizmom “kotrljajućeg kruga”
• 5’-kraj kroz pilus ulazi u stanicu recipijent
gdje se odmah sintetizira komplementarni
(zaostajući) lanac
Opiši „Muške” i „ženske” stanice pri konjugaciji
ženske stanice (recipijenti)
• nemaju F-plazmid (ne sintetiziraju F-pilus)
• označavaju se kao F–
• muške stanice (donori)
• imaju F-plazmid i sintetiziraju F-pilus
• mogu biti F+
, Hfr i F’
F + stanica
u njoj kromosom i samostalni F-Faktor
Hfr stanica
F-faktor integriran u kromosom
F ‘ stanica
kromosom samostalno a F-Faktor integriran u kromosomalnu DNA
Kako nastaje Hfr-stanica?
F-plazmid sadrži insercijske sekvencije
(dvije IS3 i jednu IS2) i transpozon Tn1000
• kromosom E. coli sadrži 2 do 5 kopija
IS2 i IS3 te više Tn1000
• homolognom rekombinacijom
može nastati više različitih Hfr-sojeva
Kako nastaje F’-stanica?
homolognom rekombinacijom
• „pogrešnim” izrezivanjem F-plazmida
iz genoma Hfr-stanice
stanica može biti diploid za neki alel
• jedan alel u kromosomu, a drugi na F-plzmidu
• dominantne i recesivne mutacije
• istraživanje esencijalnih gena
Šta je Genetičko mapiranje gena
procjena relativnog položaja gena i njihove udaljenosti na temelju
učestalosti genetičke rekombinacije
• bliski geni češće se prenose (nasljeđuju) zajedno
• genetičke mape gena
načini mapiranje gena prokariota
konjugacija
• transdukcija
Mapiranje gena konjugacijom
konjugacija Hfr i F–
• količina prenesene DNA proporcionalna je trajanju konjugacije
• prijenos DNA započinje od oriT
• za prijenos cijelog genoma potrebno je oko 100 minuta
pomiješati Hfr i F– stanice
• Hfr: divlji tip (a+, b+, c+, . . . ) osjetljiv na antibiotik (npr. streptomicin)
• F–: mutant (a-, b-, c-, . . . ) rezistentan na antibiotik (npr. streptomicin)
• prekidati konjugaciju u vremenskim intervalima i nacjepljivati na podloge na kojima mogu rasti samo rekombinanti (konjuganti)
• npr.: na podlozi s antibiotikom bez triptofana može rasti samo recipijent (donor je osjetljiv na antibiotik) koji je od donora primio
gen/gene/operon za biosintezu triptofana
Mapiranje gena transdukcijom
procjena udaljenosti i redoslijeda jako bliskih gena bliskih gena, koji se ne mogu točno mapirati konjugacijom
• bliski geni češće se prenose (nasljeđuju) zajedno
selekcija transduktanata na jedan od markera (a+, b+
ili c+)
• provjera genotipa transduktanata i izračunavanje udjela transduktanata koji su osim selekcioniranog naslijedili i neselekcionirane markere (samo jedan ili oba)
• u slučaju prikazanog redoslijeda gena i ako su transduktanti selekcionirani kao a+, manje vjerojatni događaj bi bio transduktant genotipa a+ b– c+ jer su za to potrebne 4 recipročne izmjene
