10.

Question 1

Utjecaj broja kopija gene na ekspresiju

Answer 1

Veći broj kopija gena u pravilu znači i veći broj genskih produkata (RNA i proteina) tj jaču
ekspresiju tog gena.

Question 2

Utjecaj položaja gena u genomu na ekspresiju

Answer 2

Na razinu ekspresije gena utječe položaj gena u genomu jer su pojedini dijelovi genoma
jače ili češće kondenzirani, lijevo ili desno super-uvijeni ili relaksirani.

Question 3

Razine regulacije ekspresije gena

Answer 3

DNA → broj kopija gena; položaj u genomu
transkripcija- aktivnost promotora
indukcija/represija
atenuacija
→procesiranje primarnog transkripta

RNA → transport u citoplazmu do ribosoma
→stabilnost mRNA - (interferencija RNA)
→translacija inicijacija
pristrana uporaba
sinonimnih kodona

protein(polipeptid) stabilnost polipeptida (proteina)
- smatanje proteina
- posttranslacijske modifikacije-fosforilacija
glikozilacija
metilacija
disulfidne veze
proteoliza
- transport

aktivni protein (enzim) na
odgovarajućem mjestu u
stanici ili izvan stanice

Question 4

„konstitutivni” geni,

Answer 4

oko 600 do
800 gena je stalno potrebno (tzv „housekeeping”
geni – „konstitutivni” geni, stalno eksprimirani,
potrebni za održavanje osnovnih staničnih
funkcija).

Question 5

„fakultativni” geni

Answer 5

inducibilni koji se eksprimiraju
samo kad je to nužno potrebno

Question 6

koliko košta proces ekspresije gena

Answer 6

3.000 ATP-a po jednoj
molekuli proteina.

Question 7

Regulacija ekspresije gena u bakterija

Answer 7

odvija se na tri osnovne razine:
⚫ transkripcija (sinteza mRNA)
⚫ translacija (sinteza proteina)
⚫ enzimska aktivnost proteina

Question 8

najčešća razina regulacije ekspresije gena u prokariota

Answer 8

transkripcija
tj aktivnost promotora

Question 9

cis djelujuće regije DNA

Answer 9

promotori, operatori, terminatori – nalaze se u blizini gena
čiju ekspresiju reguliraju

Question 10

trans djelujuće regije

Answer 10

geni za regulatorne proteine (ne moraju se nalaziti u blizini
gena čiju ekspresiju reguliraju

Question 11

promotor

Answer 11

mjesto vezanja RNA-polimeraze

Question 12

operator

Answer 12

mjesto vezanja regulatornog proteina (aktivator ili represor)

Question 13

Na nivou translacije kako se regulira ekspresija

Answer 13

najvažniju ulogu ima inicijacija, ali i brzina translacije koja
najviše ovisi o uporabi sinonimnih kodona.

Question 14

Pozitivna regulacija na nivou inicijacije transkripcije

Answer 14

Pozitivna – ako je regulatorni protein aktivator transkripcije

Question 15

Negativna regulacija transkripcije

Answer 15

Negativna – ako je regulatorni protein represor transkripcije

Question 16

Inducibilna regulacija na nivou inicijacije transkripcije

Answer 16

ako vezanje liganda na regulatorni protein inducira transkripciju
karakteristična je za gene i
operone koji kodiraju za proteine/enzime uključene u kataboličke biokemijske
reakcije, kao što su primjerice korištenje alternativnih izvora ugljika kao što su
laktoza i arabinoza

Question 17

Represibilna regulacija na nivou inicijacije transkripcije

Answer 17

represibilna – ako vezanje liganda na regulatorni protein reprimira transkripciju
karakteristična je za gene i
operone koji kodiraju za proteine/enzime uključene u anaboličke biokemijske reakcije
kao što su primjerice biosinteza aminokiselina

Question 18

koju su najjači promotori

Answer 18

su oni za gene koji kodiraju za rRNA (4. nastavna cjelina). Na njima se
dogodi više od 60 % transkripcija, od svih transkripcija u stanici te nastane više mRNA
nego sa svih ostalih promotora kojih ima oko 2.000.

Question 19

kolko promotora ima E. Coli

Answer 19

oko 2000

Question 20

uobičajeni promotor/operon

Answer 20

uobičajeni promotor/operon – jedan promotor
regulira ekspresiju jednog „seta” od nekoliko susjednih
ORF-ova – nastaje jedna policistronska mRNA

Question 21

divergentni promotor/operon

Answer 21

divergentni promotor/operon – jedan promotor
regulira dva „seta” susjednih gena (ORF-ova) – nastaju
dvije mRNA (u pravilu policistronske) ali ovo je jedan
operon jer je pod regulacijom jednog
promotora/operatora

Question 22

Regulon

Answer 22

Regulon je skupina gena i/ili operona koji su smješteni na udaljenim mjestima u genomu
ali su pod regulacijom istog regulatornog proteina (aktivator ili represor)

Question 23

sigma faktora

Answer 23

vežu na RNA-polimerazu
i omogućuju joj vezanje na odgovarajuće promotore.

Question 24

anti-sigma faktori

Answer 24

koji se vežu na pojedine vrste sigma
faktora sprječavajući njihovo vezanje na RNA-polimerazu i tako osiguravaju da se neke
grupe gena/operona/ORF-ova mogu, a neke ne mogu transkribirati.

Question 25

Ekspresija gena u 1 operonu kak se regulira

Answer 25

Svi geni/ORF-ovi unutar jednog operona, u pravilu su jednako eksprimirani jer se
transkribiraju u istu policistronsku mRNA. Međutim moguće je da stanica ipak ne treba sve
te genske produkte u istoj količini u istom trenutku. Ovaj problem rješava se na nivou
translacije ali i terminacijom transkripcije tijekom sinteze policistronske mRNA.

Question 26

atenuacija

Answer 26

zbog slabog terminatora (T1), određeni udio svih transkripata sadrži samo gene a i b pa će
oni biti jače eksprimirani od gena c i d. Ovaj proces naziva se atenuacija (slabi terminator
je atenuator, prigušivač), ali atenuacija unutar trp operona, o kojoj ćemo govoriti u
nastavku ovog predavanja je sasvim drugačiji proces.

Question 27

anti-terminatori

Answer 27

U stanici također postoje i antiterminatori – proteini koji mogu poništiti
djelovanje terminatora unutar transkripta (atenuator), tako da modificiraju
RNA-polimerazu tako da ona ignorira atenuatore. Najbolje opisana
antiterminacija događa se u E.coli koja je inficirana bakteriofagom lambda

Question 28

Najčešći način regulacije ekspresije gena transkripcijom

Answer 28

indukcijom i represijom transkripcije,
a najčešće se osniva na postojanju represora

represor ima afinitet za vezanje na operator
⚫ operator se nalazi tik do promotora ili se s njim djelomično preklapa
⚫ vezanje represora na operator sprječava polimerazu da se veže na
promotor ili da započne transkripciju

Question 29

koje gene sadrži Operon lac

Answer 29

sadrži gene koji bakterijama omogućavaju korištenje laktoze

Question 30

koje gene sadrži Operon ara

Answer 30

sadrži gene koji bakterijama omogućavaju korištenje arabinoze

Question 31

koju gene sadrži Operon trp

Answer 31

sadrži gene potrebne za biosintezu triptofana

Question 32

Operon lac

Answer 32

pod regulacijom jednog promotora/operatora nalaze tri ORF-a:
⚫ lacZ – kodira za β-galaktozidazu, intracelularni enzim koji koja cijepa laktozu na glukozu
i galaktozu ali nastaje i alolaktoza
⚫ lacY – kodira za permeazu, transmembranski protein koji omogućava transport laktoze
u stanicu
⚫ lacA – kodira za intracelularni enzim galaktozid transacetilazu čija uloga u stanici još nije
razjašnjena
promotor i operator se preklapaju
 za protein represor kodira gen lacI
⚫ nije dio operona lac (transkribira se sa vlastitog promotora) pa je trans-djelujući element
⚫ ima afinitet za vezanje na operator operona lac te sprječava vezanje RNA-polimeraze na
promotor
⚫ ima afinitet za alolaktozu koja mu mijenja konformaciju te se on više ne može vezati
za operator

za katabolizam laktoze
neophodni su produkti
gena lacZ i lacY

β-galaktozidaza
⚫ hidrolizira laktozu na glukozu i galaktozu
ali mali dio laktoze prevodi (transglikolizira)
i u alolaktozu koju također hidrolizira na
glukozu i galaktozu pa zapravo nastaje
mali udio alolaktoze
⚫ alolaktoza se veže na represor te se on
više ne može vezati na operator
Lac represor
⚫ sadrži helix-turn-helix motiv (karakterističan za proteine koji se vežu na DNA, 2. nastavna
cjelina) koji ostvaruje interakciju s velikim utorom DNA i tako omogućava specifični
kontakt Lac represora s operatorskom regijom DNA
⚫ Lac represor je homotetramerni protein (sastoji se od 4 identične podjedinice), pri
čemu se dvije vežu na jednu, a druge dvije na drugu polovinu operatorske regije – Lac
represor je zapravo dimer dvaju dimera

operator sadrži dvije invertno
(obrnuto) ponovljne sekvencije (nisu identične) na koje se veže dimer dvaju dimera
Lac represora (svaki dimer na jedno ponavljanje)

Lac represor, osim za operator operona lac ima afinitet i za alolaktozu (derivat
laktoze koji nastaje djelovanjem β-galaktozidaze čiji ORF se nalazi unutar operona lac).
Vezanje alolaktoze za Lac represor, mijenja konformaciju represora pa se on više
ne može vezati na operator.

Question 33

za šta kodira lacZ

Answer 33

kodira za β-galaktozidazu, intracelularni enzim koji koja cijepa laktozu na glukozu
i galaktozu ali nastaje i alolaktoza

Question 34

za šta kodira lacY

Answer 34

kodira za permeazu, transmembranski protein koji omogućava transport laktoze
u stanicu

Question 35

za šta kodira lacA

Answer 35

kodira za intracelularni enzim galaktozid transacetilazu čija uloga u stanici još nije
razjašnjena

Question 36

Kakav element je lacI

Answer 36

nije dio operona lac (transkribira se sa vlastitog promotora) pa je trans-djelujući element

Question 37

Građa Lac represora

Answer 37

sadrži helix-turn-helix motiv (karakterističan za proteine koji se vežu na DNA, 2. nastavna
cjelina) koji ostvaruje interakciju s velikim utorom DNA i tako omogućava specifični
kontakt Lac represora s operatorskom regijom DNA
⚫ Lac represor je homotetramerni protein (sastoji se od 4 identične podjedinice), pri
čemu se dvije vežu na jednu, a druge dvije na drugu polovinu operatorske regije – Lac
represor je zapravo dimer dvaju dimera
operator sadrži dvije invertno
(obrnuto) ponovljne sekvencije (nisu identične) na koje se veže dimer dvaju dimera
Lac represora (svaki dimer na jedno ponavljanje)
Lac represor, osim za operator operona lac ima afinitet i za alolaktozu (derivat
laktoze koji nastaje djelovanjem β-galaktozidaze čiji ORF se nalazi unutar operona lac).
Vezanje alolaktoze za Lac represor, mijenja konformaciju represora pa se on više
ne može vezati na operator.

Question 38

Kakva je ekspresija lac I

Answer 38

Neovisno o prisutnosti laktoze, gen
lacI je konstitutivno (stalno)
eksprimiran, te u stanici ima desetak
molekula represora LacI

Question 39

Regulacija operona lac U odsustvu laktoze

Answer 39

U odsustvu laktoze represor LacI
vezanjem na operator reprimira
operon lac, ali ne u potpunosti pa u
stanici ima oko 5 molekula βgalaktozidaze

Question 40

Regulacija operona lac U prisustvu laktoze

Answer 40

U prisustvu laktoze zahvaljujući
prisutnoj β-galaktozidazi nastaje
alolaktoza koja se veže na represor LacI
te se on više ne može vezati na operator
zbog čega nastupa indukcija operona lac
koja je potrebna za korištenje laktoze

Question 41

Regulacija operona lac U prisustvu glukoze i laktoze

Answer 41

U prisustvu glukoze i laktoze, E.coli najprije metabolizira glukozu, a na
metaboliziranje laktoze prelazi tek kad nestane glukoze jer je operon lac reprimiran
glukozom. Ovaj slučaj represije gena za korištenje alternativnog izvora ugljika
(laktoze), u prisustvu izvora ugljika koji se lako metabolizira (glukoza), naziva se
katabolička represija.

Question 42

katabolička represija

Answer 42

Ovaj slučaj represije gena za korištenje alternativnog izvora ugljika
(laktoze), u prisustvu izvora ugljika koji se lako metabolizira (glukoza), naziva se
katabolička represija.

Question 43

Mehanizam kataboličke represije

Answer 43

U prisutnosti glukoze u stanici je visoka razina ATP-a i niska razina cAMP-a (zbog
aktivnosti cAMP fosfodiesteraze)
⚫ U odsustvu glukoze, aktivira se adenilat ciklaza te raste razina cAMP-a pa se on veže
na CRP („cAMP receptor protein”, poznat i pod nazivom CAP – „catabolite activator
protein”)
⚫ Zbog vezanja cAMP na CRP (CAP), CRP mijenja konformaciju te se kompleks cAMPCRP
veže uzvodno od promotora na regiju od -72 do -52 i stupa u direktnu interakciju s
RNA-polimerazom što omogućava njeno vezanje na promotor te dolazi do potpune
aktivacije operona lac. CRP (CAP) je aktivator operona lac.
⚫ U odsutnosti kompleksa cAMP-CRP, odnosno u prisutnosti glukoze, RNA-polimeraza se s
malim afinitetom veže na promotor operona lac.

Question 44

Vrsta regulacije lac operona

Answer 44

negativno (zbog represora LacI) i pozitivno reguliran (zbog
aktivatora cAMP-CRP), a oba načina regulacije su inducibilna jer ligandi (alolaktoza
ili cAMP) aktiviraju transkripciju

Question 45

Regulacija operona ara U odsutnosti arabinoze

Answer 45

odsutnosti arabinoze, dimer regulatornog proteina AraC istovremeno se veže na
dvije udaljene regije DNA čime savija DNA i tako reprimira transkripciju s promotora
operona ara

Question 46

regulatorni protein za opeon Ara je

Answer 46

Ara C

Question 47

Regulacija operona ara U prisutnosti arabinoze

Answer 47

Vezanje arabinoze na AraC uzrokuje promjenu njegove konformacije tako da se on
više ne može istovremeni vezati na udaljene regije pa ne može ni saviti DNA.
Umjesto toga, veže se na dvije bliske regije u blizini promotora i djeluje kao aktivator
transkripcije.

Question 48

Način regulacije operona Ara

Answer 48

Regulatorni protein može biti i aktivator i
represor (pozitivna i negativna regulacija), ali je
način regulacije inducibilan jer ligand (arabinoza)
inducira transkripciju

Question 49

Način regulacije operona Trp

Answer 49

operon trp
je represibilan jer se reprimira produktom biosintetskog puta (triptofan).
 Regulatorni protein represor TrpR može se vezati za operator (i tako reprimirati
sintezu triptofana) samo ako se na njega veže triptofan. Stoga je operon trp
negativno-represibilno reguliran – jer je protein regulator represor, a ligand
(triptofan) reprimira transkripciju.

može biti i prigušivanjem

Question 50

Način Regulacije operona Trp

Answer 50

Operon trp između mjesta početka transkripcije i prvog gena (ORF-a) sadrži tzv.
vodeću (leader) sekvenciju duljine 162 pb
⚫ Vodeća sekvencija sadrži dva obrnuta ponavljanja (ukupno 4 ponovljene regije koje
nisu identične)
Nakon transkripcije
mRNA, atenuator
sadrži 4 međusobno
komplementarne regije
koje mogu formirati
strukture ukosnice

Čim se sintetizira dovoljno dugački dio mRNA na njega se veže ribosom i započne
translaciju, ali ubrzo dolazi do regije koja sadrži dva kodona za triptofan, dakle, da bi
se translacija mogla nastaviti, neophodno je da u stanici ima dovoljno triptofana

Bez utjecaja translacije (ribosoma) sparuju se
regija 1 i 2 te regija 3 i 4, pri čemu sparivanje regije 3
i 4 tvori terminator transkripcije.
⚫ U odsustvu triptofana, ribosom zastaje na
kodonima za tiptofan unutar regije 1 i time sprječava
sparivanje regija 1 i 2, ali se sparuju regije 2 i 3 koje
ne tvore terminator.
⚫ U prisustvu triptofana, ribosom neometano dolazi
do stop kodona koji se nalazi odmah iza regije 1.
Ovdje će ribosom disocirati s RNA, ali se ipak zadrži
dovoljno dugo da spriječi sparivanje regije 2 i 3.
Stoga se sparuju regije 3 i 4 koje tvore terminator
transkripcije.

Question 51

Regulacija na nivou translacije – vezanje ribosoma

Answer 51

Ima puno manji utjecaj ma ekspresiju gena od regulacije transkripcije
⚫ Uzvodno od start kodona na mRNA se nalazi mjesto za vezanje ribosoma
(Shine-Dalgarno, oko 8 nukleotida uzvodno od AUG) koje varira u sekvenciji i
udaljenosti od start kodona ali jači utjecaj na regulaciju ekspresiju gena ima
udaljenost od start kodona.
⚫ Pri translaciji policistronske mRNA nakon translacije prvog gena (ORF-a)
ribosom može disocirati s mRNA pa se ponovno mora vezati za mRNA da bi
translatirao slijedeći ORF, a to može rezultirati smanjenom razinom translacije
nizvodnih ORF-ova. Međutim, u mnogim slučajevima start kodon slijedećeg
ORF-a može biti jako blizu (nekoliko parova baza) ili se čak preklapati sa stop
kodonom prethodnog ORF-a. U ovom slučaju uopće ne dolazi do disocijacije
30S podjedinice ribosoma, nego ona odmah stupa u interakciju sa start
kodonom slijedećeg ORF-a.

Question 52

pristrana uporaba sinonimnih kodona
(„codon bias”)

Answer 52

Regulacija na nivou translacije
Poznato je da za mnoge aminokiseline postoje sinonimni kodoni, ali u
nekim slučajevima pojedine tRNA prepoznaju samo pojedine sinonimne
kodone pri čemu neke od tih tRNA u stanici mogu biti prisutne u malom
broju. Zbog toga različiti organizmi/vrste imaju specifični „codon bias”,
odnosno u genima se značajno više pojavljuju samo pojedini sinonimni
kodoni. Zbog svega navedenog, geni koji odstupaju od pristrane uporabe
sinonimnih kodona za dotični organizam/vrstu slabije su eksprimirani
zbog znatno sporije translacije. Ovo je jako važno pri ekspresiji
gena/proteina iz jedne vrste u drugoj vrsti. Za uspješnu ekspresiju
neophodno je optimizirati kodone gena koji se eksprimira na način da se
poštuje „codon bias” organizma u kojem ga želimo eksprimirati.

Question 53

Reakcija stance na vanjske uvjete i mehanizam

Answer 53

Regulacija ekspresije operona lac, ara i trp primjer su kako stanica reagira
na signale unutar stanice (prisutnost nekog izvora uljika ili produkta
biosisnteze). Međutim, bakterijske stanice reagiraju i na signale iz
okoline. Jedan primjer sustava koji to omogućava temelji se
transmembranskom proteinu koji se naziva histidin protein kinaza (HPK) i
citoplazmatskom proteinu RR („response regulator”). Mehanizam regulacije je
slijedeći:
• ligand iz okoline stupa u interakciju s domenom HPK koja se nalazi na
vanjskoj strani stanične membrane
• to uzrokuje autofosforilaciju jednog histidina u domeni HPK koja se nalazi
na unutrašnjoj strani membrane
• fosfatna grupa se prenosi na RR koji se u fosforiliranom obliku može
vezati na DNA i regulirati transkripciju odgovarajućih gena/operona

Question 54

Regulatore RNA – RNA termometri

Answer 54

mRNA koje reguliraju ekspresiju gena ovisno o temperaturi jer na 5’-kraju (pri nižim
temperaturama) tvore sekundarne strukture koje mogu spriječiti vezanje ribosoma. Jedan
ovakav element pronađen je u E.coli uzvodno od gena rpoH koji kodira za σ-faktor σ32
(veže se na RNA-polimerazu i omogućava joj da transkribira „heat-shock” gene koji su
potrebni za preživljavanje na povišenoj temperaturi).
⚫ Mnoge patogene bakterije na ovaj način detektiraju povećanje temperature na 30 do
37°C kao znak da se nalaze u, primjerice, ljudskom organizmu pa dolazi do ekspresije
gena odgovornih za virulenciju i preživljavanje unutar životinjskog organizma.

Question 55

Male regulatorne RNA

Answer 55

U prethodnim primjerima, regulatorna RNA je zapravo dio mRNA (njen netranslatirani 5’-
kraj). Međutim, male regulatorne RNA eksprimiraju se neovisno od gena čiju ekspresiju
reguliraju, a djeluju tako da se komplementarno sparuju s mRNA utječući na njenu
stabilnost ili uspješnost translacije (slično interferenciji RNA u eukariota)