5. Mutagénèse in vitro et recombineering

Question 1

Qu’est-ce qu’une mutation ?

Answer 1

• Changement d’une base dans une molécule d’Adn donnée (dans un organisme ou in vitro sur des fragments clonés dans un plasmide ou amplifiés par PCR)

Question 2

Quels sont les 3 types de mutations possibles, nommez-les et expliquez:

Answer 2

1. Délétion (enlève une Nt)
   2. Insertion (ajout d’une Nt)
   3. Substitution (chmt de base pour une autre)

Question 3

Nommez les deux région que les mutations peuvent agir et l’effet:

Answer 3

1. Affectant les régions codantes (exons)
   - Missense : chmt de base
   - Nonsense : terminaison
   - Silent : silencieuse donc aucun effets
   - Souvent utilisé pour découvrir la fx d’un gène (on regarde l’effet de la mutation
   sur le phénotype)
2. Affectant les régions non-codantes (introns)
   - Gain/perte de sites de liaisons (régulateurs)
   - Chmt dans l’expression des gènes.

Question 4

Qu’est-ce que la mutagénèse ?

Answer 4

C’est l’action d’apporter des mutations à une molécule d’ADN

Question 5

Quelles sont les deux types de mutagénèse possibles, expliquez-les ?

Answer 5

1. Aléatoire : peut se produire n’importe où dans le génome (avec des agents mutagènes UV, radiations, produits chimiques)
2. Dirigée : se produit sur un seul site en particulier dans le génome (avec des approches de biologie moléculaire)

Question 6

Qu’est-ce que la mutagénèse dirigée par PCR ?

Answer 6

• L’utilisation d’amorces pour introduire de courtes mutations de manière ciblée
• Les amorces de la PCR contiennent des bases modifiées : lors de la polymérisation (élongation), les mutations sont incorporées dans un nouvel amplicon.

Question 7

Expliquez comment on fait un substitution et une délétion par mutagénèse dirigée par PCR.

Answer 7

1. Substitution:
   - Apporter une mutation dans 1 des 2 amorces de PCR
   - Lors de l’amplification par PCR, on se retrouve avec un produit amplifié dont la
   séquence est différent de la séquence matrice
   - Possible de faire faire une substitution au milieu de l’amorces (1-3 Nt max) ou en
   5’-terminal de l’amorce et pouvoir ajouter une étiquette jusqu’à une 100aine de
   Nt.
2. Délétion:
   - Concevoir une amorce qui va s’hybrider de part et d’autre de la séquence (donc
   formation d’une espèce de boucle)
   - Max 1-3 Nt, sinon ça va nuire à l’hybridation de l’amorce

Question 8

En quoi consiste un PCR fusion ?

Answer 8

• Assembler des produits de PCR contenant certaines mutations
  - Ajouter en bout 5’ de l’amorce des séquences d’homologie

Question 9

Expliquez en détails un PCR fusion (par exemple pour faire une insertion ou délétion)

Answer 9

1. Faire deux rx de PCR séparées ( #1 amorce A et B+homologie , #2 amorces C+homologie et D)
2. Mélanger les produits des deux rx, ajouter seulement les deux amorces A et D
3. Les séquences chevauchantes servent d’amorces dans les premiers cycles.
4. Amplification de fragment recombinés

• Ça permet d’ajouter une insertion ou de faire une délétion grâce à la partie d’homologie ajouté en 5’ l’amorce

Question 10

Vrai ou faux.

Il est aussi possible d’utiliser la méthode de Gibson et la recombinaison in vivo pour assembler des fragments (PCR fusion n’est pas la seule option).

Answer 10

Vrai

Question 11

Quelle est la méthode de mutagénèse dirigée par PCR qui fonctionne bien pour faire une substitution, une délétion, une petite insertion ou même une grande insertion dans petits plasmides ?

Answer 11

Modification de plasmides complets par PCR

Question 12

Expliquez la modifications de plasmides complets par PCR

Answer 12

• Méthode qui consiste à amplifier un plasmide de façon linéaire avec des
  amorces contenant la modification, phosphorylées en 5’
  
  • Religer le plasmide après amplification (bouts plasmide phorsphorylés en 5’ =
    auto-ligation)
  • Et transformer le plasmide dans un bactéries

Question 13

Expliquez comment il est possible de faire une substitution, une délétion, une petite insertion ou même une grande insertion dans des petits plasmides avec la méthode de modification de plasmides par PCR

Answer 13

• Substitution
  - Amplifier un vecteur complet avec des amorces modifiés (modification
  NT dans l’amorce)
• Délétion
  - Décaler le point de départ des deux amorces (donc exclusion de la portion à
  déléter)
• Small insertion
  - Ajouter en 5’ d’une amorce une petite séquence
• Large insertion
  - Ajouter en 5’ des amorces une séquence de max 100 Nt

Question 14

Un des problèmes potentiel avec la méthode de modification de plasmides par PCR est de se retrouver avec des plasmides original transformé dans les bactéries au lieu du plasmides modifié. Que faire pour éviter ça ?

Answer 14

• On va méthyler le plasmide original
• Les nouvelles copies du plasmide muté ne le sont pas, on peut donc utiliser le site DpnI méthylé pour couper le plasmide avec une enzyme de restriction = élimination du plasmide matrice original

Question 15

Parlez-moi de la conception des amorces et de l’amplification pour la méthode de modification de plasmides par PCR :

Answer 15

• Amorces:
  Il est primordial d’avoir au moins 10 Nt d’homologie parfaite en 3’ afin d’avoir une bonne hybridation de l’amorce.
• Amplification :
  Il est important d’avoir une pol de haute fidélité (activité 3’-> 5’ exo) avec une bonne precessivité car on a souvent de long plasmides (au moins 5000 bases). Également une pol qui laisse des extrémités franches pour éviter le repliement de plasmide (idéale = KOD)

Question 16

Comment choisir entre en assemblage de produits par PCR ou la modification d’un plasmide complet ? Quelles sont els deux choses à considérer ?

Answer 16

• Le nombre et la taille des PCR à accomplir et à assembler
• Le PCR n’est pas parfait à 100%. Plus le produit est long et plus il y aura de chances de mutations pendant la rx d’amplification.

Question 17

Comment peut-on faire la synthèse d’un morceau d’Adn qui n’existe pas dans la nature ?

Answer 17

• Utiliser le PCA : Polymerase cycling assembly
• Fonctionne bien pour la synthèse de fragments de quelques centaines de paires de base

1. Utiliser plusieurs oligonucléotides de 40-75 pb ayant des régions de chevauchement en 3’
2. Les premiers cycle de PCR = courts fragments qui s’assemblent progressivement
3. Les amorces externes en excès promeut la synthèse de fragments courts

Question 18

On peut utiliser la mutagénèse dirigée par recombinaison homologue in vivo, expliquez:

Answer 18

• Souvent utilisé pour étudier la fx des gènes.
• Utilisation de la recombinaison homologue pour introduire un segment muté contenant un marquer de sélection (permettant la sélection du génome muté dans l’organisme)
• La recombinaison homologue permet le remplacement de la région allélique de la cassette puis l’amplification apr PCR

Question 19

Expliquez la recombinaison homologue avec un produit de PCR:

Answer 19

• Utilisation de la PCR pour amplifier une portion donnée avec des amorces (ajouter des extrémités en 5’ qui vont porter l’homologie de séquence)
• Possible de faire une sélection d’organismes en ajoutant un gène ATBr
• Efficace chez la levure et certains autres organisme
• Toujours s’assurer que la cassette est au bon endroit en faisant une PCR diagnostique.

Question 20

Parlez-moi du Recombineering-mutagénèse dirigée chez les bactéries :

Answer 20

• Il est possible d’augmenter le taux de recombinaison chez les bactéries à l’aide d’un système de recombinaison spécialisé tiré d’un bactériophage.
• Système impliqué : lambda Red
• Fonctionne avec des oligonucléotides sb ou des produits de PCR db. Besoin d’au moins 35 bases d’homologie autour de la mutation.

Question 21

Quelles sont les 3 composantes du système lambda Red :

Answer 21

• Utilisé pour augmenter le taux de recombinaison chez les bactéries (ex: E.Coli, Salmonella, Vibrio)
• Protéines impliquées :
  1. Gam : prévient la dégrade des ADN linéaire db par RecBCD et SbcCD
  2. Exo : Dégrade un brin de l’ADN de 5’ -> 3’ pour créer une molécule d’ADNsb
  3. Beta: Lie l’ADNsb produite par Exo et promouvoir l’invasion du brin homologue
  de manière indépendant de RecA

Question 22

Expliquez en quoi consiste le système lambda Red avec des oligo sb:

Answer 22

• Conception d’un fragment (oligonucléotide) qui est conçue pour cibler l’ADN du brin retardé lors de la réplication
• La bactérie va répliquer son génome, donc va dérouler l’ADN. La protéine Beta du système Red va donc venir s’hybrider et va servir d’amorce pour la polymérisation de l’ADN.

Question 23

Expliquez en quoi consiste le système lambda Red avec des de l’ADN db ?

Answer 23

1. On transforme la cassette dans les bactéries qui ont lambda Red
2. Exo dégrade un des 2 brins d’ADN pour laisser sb
3. La bactéries va protéger le brin sb et donc l’ADNsb recombinogène va être incorporé dans le brin retardé de la fourche de réplication
4. Une homologie de 40 pb est nécessaire de chaque côté de la cassette de recombinaison pour que la rx soit efficace.

Question 24

Vrai ou faux système lambda Rad
1. La présence de liens phosphorothioates en 5’ protègent le brin retardé de la fourche de réplication et augmente l’efficacité de la mutagénèse ?

2. On peut utiliser la méthode lambda Red autant dans la mutagénèse avec un oligonucléotide ou avec un produit de PCR db ?
3. Avec le système lambda Rad, il est possible de faire la mutagénèse de n’importe quel fragment d’ADN soumis à la réplication par E. coli ?

Answer 24

1. Vrai
   2. Vrai
   3. Vrai (génome, plasmide, etc)

Question 25

Quel est l’objectif d’une endonucléase programmée ?

Answer 25

• Créer un site de coupure db dirigé à un endroit précis dans le génome.
  
  • La cassure de l’ADN, qui devra être réparée pour assurer la survie de la cellule, amène l’opportunité de modifier le génome à l’endroit où la coupure s’est produite.
  • On veut donc diminuer les faux positifs !!

Question 26

Quelles sont les 3 principales méthodes d’endonucléases programmées ?

Answer 26

1. Zn fingers nuclease
   2. TALE fingers nuclease
   3. CRISPR/Cas9

Question 27

Expliquez en quoi consiste la méthode de Zn fingers nuclease:

Answer 27

• Le motif en doigt de zinc reconnait un motifs déterminés (1 motif reconnait 3 pb spécifiques)
  
  • Plusieurs motifs s’associent pour cibler une région spécifique
  • Les motifs associés vont fusionner avec Fokl (une endonucléases non spécifique)
  • Création de 2 complexes Zn+Fokl, pour cibler la séquence en amont et en aval.
  • Fusion des deux domaines Fokl = formation d’un dimère
  • Fokl doit se dimériser pour fonctionner, donc on cible les deux brins de façon simultanée
  • Coupure , possibilité d’insérer une nouvelle séquence ou possibilité de créer une délétion partielle.

Question 28

Quelles sont les 2 avantages et 3 inconvénients de l’endonucléase programmée Zn fingers ?

Answer 28

• Avantages:
  1. Percée majeure au moment de sa découverte
  2. Était la seule manière de cibler une cassure dans un génome animal avec une certaine précision
  • Inconvénients:
    
    1. Approche compliquée : bcp de mise au point
    2. Coût élevé
    3. Fort risque de sites off-target (mutagénèse involontaire, toxicité)

Question 29

Expliquez en quoi consiste la méthode d’endonucléase programmées TALEN

Answer 29

• Basé sur un motif Tal effector qui existe chez les b Xanthomonas
• Domaine de liaison (constitué de 33-34 a.a identiques sauf le 12 et 13.) qui reconnait 1 Nt spécifique
• C’est grâce à l’a.a. 12-13 qu’on a une spécificité de Nt !
• On utilise un assemblage de domaine de liaison pour cibler une région génomique spécifique
• L’assemblage va créer une hélice autour de l’ADN = quand motif de chaque côté de l’ADN se rejoignent = cassure ciblée

Question 30

Quelles sont les 2 avantages et 2 inconvénients de la méthode d’endonucléase programmées TALEN ?

Answer 30

Avantages:
1. Offre une meilleure spécificité que les ZFN (moins de off-target, donc
moins de mutations involontaires/toxicité)
2. Plus facile à designer

Inconvénients:

	1. Dur à construire (par génie génétique)
	2. Grosse protéine difficile à introduire dans les cellules

Question 31

Quelles serait une méthode idéale pour assembler les motifs TALEN ?

Answer 31

La méthode Golden Gate permettrait d’amplifier chacun des fragments, des les chevaucher et de les assembler simultanément.

Question 32

Expliquez en quoi consiste la méthode CRISPR/Cas9 :

Answer 32

• C’est une méthode dérivée d’un système de défense bactérien contre les plasmides/transposons/virus
  
  • Système simple et efficace, beaucoup plus facile à concevoir et à utiliser que Zn et TALEN
  • Permet de couper et d’insérer de l’ADN dans le locus CRISPER (séquence répétées entrecroisées de milliers de séquences uniques).
  • Ne nécessite que la prot Cas9 et un court ARNguide qui détermine le site de coupure

Question 33

Décrivez les mots suivants en lien avec CRISPR/Cas9

Answer 33

• ARNg : tige boucle d’ADN qui permet l’association avec Cas9
• Spacer: 20 Nt présent dans l’ARNguide qui permet de s’apparier avec l’ADN db pour apporter la reconnaissance spécifique
• Protospacer : Séquence reconnue dans L’ADN en aval d’un PAM
• Protospacer adjacent motif (PAM) : suit le protospacer, courte séquence adjacente au protospacer nécessaire pour la reconnaissance par le complexe Cas9-RNAguide

Question 34

Vrai ou Faux CRISPR/Cas9 :
1. On peut cibler n’importe qu’elle séquence qui contient des motifs répétés

2. Il est possible de transformer un vecteur avec Cas9 dans des cellules de mammifères

Answer 34

1. Faux !! Doit avoir une séquence PAM (mais le PAM peut être très fréquent (ex: 2 Nt)
2. Vrai ! On retrouve dans un seul vecteur le promoteur avec Cas9 et la séquence ARNguide. On va transformer ce plasmide dans la bactérie qui va transcrire le plasmide = expression Cas9 et ARNguide

Question 35

Quelles sont les 4 avantages et l’inconvénient de la méthode d’endonucléase programmées TALEN ?

Answer 35

Avantages:

	1. Design simple
	2. Construction facile
	3. Moins dispendieux
	4. Peu de site off-target

Inconvénients:
1. Risque d’acquisition du gène Cas9 par les c cibles (risque de mutagénèse
involontaire, ais une solution existe)

Question 36

Quelle est la solution pour empêcher l’acquisition du gène Cas9 ?

Answer 36

• Injecter des particules Cas9
  
  • Synthèse des particules in vitro (Cas9 et ARNguide)
  • On va injecter la particule et donc elle ne pourra pas se répliquer = moins de risques de causer des dommages à l’ADN.

Question 37

Nommez les 3 applications possibles de CRISPR/Cas9 :

Answer 37

1. Mutagénèse in vivo par clivage db (mutagénèse spontanée ou insertion d’ADN exogène)
   - Requiert activité nucléase de Cas9 (permet de casser l’ADN)
   - On peut soi faire de la recombinaison homologue ou non-homologue (erreurs++,
   parfait pour inactiver un gène)
2. Mutagénèse in vivo par clivage simple-brin décalé (insertion d’ADN exogène)
   - Requiert activité nickase de Cas9 modifié et un ADN donneur pour faire le
   remplacement allélique
   - Permet d’augmenter la spécificité ( moins de off-targets)
3. Recrutement sans activité nucléase (activateurs, répresseurs, marqueurs)
   - Cas9 sans activité nucléase, complexe stabilité sur l’ADN à son site
   - Sert à créer un fusion protéique avec Cas9 et une protéine fonctionnelle
   (activateur, répresseur, GFP, etc)

Question 38

Pourquoi peut-on se servir de CRISPR/Cas9 comme gene drive, expliquez ?

Answer 38

• Cas9, un ARN guide et un gène cargo = permet de causer des cassures db avec des bouts cohésifs pour favoriser la recombinaison homologue
  
  • Permet de propager une modification génétique très rapidement dans une population donnée
  • On cible un gène précis et on le rend homozygote, donc la descendance va forcément être hétérozygote !
  • Ex: utilisation avec la drosophile. Quand elle va se reproduire, la descendance sera porteur de l’allèle en question !

Question 39

Donnez un exemple concret de gene-drive :

Answer 39

• Éliminer le vecteur de la malaria : un parasite eucaryote unicellulaire (plasmodium falciparum)
  
  • Les parasites infectent les humains par les moustiques infectés (moustique = vecteur)
  • Utilisation du gene-drive pour rendre les moustiques résistants à l’infection (mutation de FREP1).

Question 40

Pourquoi transfère-t-on la protéine Cas9 avec son ARNguide au lieu du gène Cas9 ?

Answer 40

Parce que ça réduit le risque de site off-targets puisque la protéine ne peut pas se répliquer dans les cellules cibles. Au bout de quelques divisions cellulaire la protéine va tout simplement disparaitre.

Question 41

Quelles sont les potentielles application de Cas9 chez les humains ?

Answer 41

1- Modifier le génome humain pour réparer des allèles défectueuses

(ex: maladies génétiques)
- Ex vivo : cancer du sang, anémie falciforme : on isole les cellules, on les modifie , on les multiplie puis on les réinjecte au pt
- In vivo : Neuropathie optique héréditaire de Leber : injection directe de CRISP-Cas9 dans les tissus infectés

2- Design de bébés : modif de cellules souches