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TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire > 4. PCR et méthode de clonage moléculaire et biologie synthétique > Flashcards

4. PCR et méthode de clonage moléculaire et biologie synthétique Flashcards

1
Q

Qu’est-ce que la PCR et qui l’a inventé ?

A
  • Idée publiée en 1971 (pol E. coli sensible à la chaleur, donc on devait en ajouter à chaque cycle)
  • Kary Mullis apporte l’idée de la Taq polymérase (qui résiste à la chaleur car polymérise à 72°C)
  • PCR = permet d,amplifier des fragments linéaires d’ADNdb par un facteur >106-107
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2
Q

Pourquoi l’arrivée de la pol Taq thermophile est une révolution ?

A
  • Car elle polymérise à 72°C, ça permet donc de ne pas à avoir à ajouter de la pol à chaque étape
  • Permet aussi d’avoir des rx plus spécifiques
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Q

Vrai ou faux, un brevet a été déposé pour la PCR et l’utilisation de la Taq ADN polymérase.

A
  • Vrai !

- Déposé en 1985, expiré en 2005

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4
Q

Expliquez le principe de la PCR (mécanisme):

A

Expliquez le principe de la PCR (mécanisme):

  • Amplification exponentielle d’une séquence précise
  • Ajout d’amorces aux deux extrémités (extrémité 3’ qui permet d’amorcer la polymérisation)
  • Fait par une polymérase thermophile
  • Bout d’ADN : génomique ou provient d’un vecteur. Le fragment est beaucoup plus long que la séquence cible généralement.
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5
Q

Pourquoi dit-on que l’amplification commence seulement au 3e cycle ?

A

Dans les deux premiers cycles, la séquence cible n’est pas totalement présente. Les brins filles servent de brin matrice et c’est seulement à partir du cycle 3, que la séquence cible comment à être polymérisée.

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6
Q

Vrai ou faux, il est possible de faire un rx de PCR avec 1 seule amorce ?

A
  • Vrai ! Si rx se fait avec 1 seule amorce = amplification linéaire
    - 2 amorces = rx exponentielle ( 2 brins servent de matrice)
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7
Q

Nommez les 5 composantes générales d’un rx de PCR:

A
  • Tampon (tampère la rx)
    - dNTPs (Nt nécessaire lors de la polymérisation)
    - Amorces (habituellement 2 pour faire rx exponentielle)
    - Matrice d’ADN à amplifier
    - Polymérase thermophile (Taq ou autres)
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8
Q

Décrivez les étapes du cycle de PCR classique :

A

1) Dénaturation initiale 30 sec à 94°C
2) **Dénaturation 30 sec à 94°C
3) **Renaturation 30-60 sec à qq ° sous le Tm
4) ***Élongation 45-60 sec à 72°C (Taq pol travaille optimalement à 72°C, ~1 kb/ min)
- Répéter le cycle au moins 20 fois (30-40) dans le but d’avoir une grande quantité d’ADN cible
5) Élongation finale 5-7 min à 72°C
- Élongation finale pour faire tout les fragment db pour passer à l’étape de clonage ou d’hybridation avec des adaptateurs par exemple

*** = 1 cycle

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9
Q

Vrai ou Faux : Est-ce possible d’avoir un modèle de PCR différent que le cycle classique de PCR ?

A
  • Vrai !

- Tant que les étapes reste dans le bon ordre.

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10
Q

Qu’est-ce que le Two-step PCR ?

A
  • C’est une rx de PCR dans laquelle on saute l’étape d’élongation
  • C’est utilisé pour sauver du temps ! Au lieu ~3h = 1h
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11
Q

Quelles sont les conditions nécessaires pour faire une Two-step PCR ?

A
  • Amorces au Tm élevé (>67°C)
  • Produits de PCR courts
  • Polymérase rapide ++
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12
Q

Vrai ou faux sur les amorces spécifiques PCR :

1) 2 amorces spécifiques orientées convergentes = amplification exponentielle
2) Il est possible de faire une amplification linéaire en utilisant une seule amorce
3) La longueur des amorces varies selon le Tm (Tm dicte la longueur des amorces)

A

1) Vrai
2) Vrai
3) Vrai ( ~20-30 Nt)

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13
Q

Pourquoi dit-on que le Tm dicte la longueur des amorces de PCR ?

A

La longueur des amorces dépends du contenu en AT ou en GC. Plus une amorce est riche en AT et plus elle sera longue pour compenser la T° hybridation plus faible (Tm).

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14
Q

Comment fait-on pour augmenter la spécificité des amorces ?

A

Comment fait-on pour augmenter la spécificité des amorces ?

	- Augmenter le Tm
	- Augmenter le contenu en GC
	- Des amorces plus longues pour compenser un contenu en AT trop élevé.
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15
Q

Pourquoi faut-il éviter des amorces qui ont tendance à former des Tiges-boucles/structures secondaires/dimères ?

A

Parce que ces structures vont compétitioner avec l’hybridation des produits spécifiques !!

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16
Q

Est-il préférable d’utiliser une T° de renaturation semblable entre les 2 amorces de la rx ?

A
  • Oui !

- Tm +/- 5°C entre els 2 amorces

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17
Q

Quel est le point le plus important à se souvenir sur les amorces spécifiques de PCR ?

A
  • Elles ne sont pas phosphorylées en 5’
  • Il faut absolument les phosphoryler ou les couper avec une enzymes de restriction pour que l’enzyme les phosphoryle en 5’.
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18
Q

Expliquez qu’est-ce que la température de fusion:

A
  • C’est le Tm (melting temperature), température à laquelle théoriquement 50% des amorces sont hybridées.
    - Au dessus du Tm = sb
    - Sous le Tm = db
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19
Q

Pourquoi l’étape d’hybridation se fait-elle à qq ° sous le Tm ?

A
  • Pour favoriser l’hybridation des amorces sur le brin matrice (hybridation db favorisée)
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20
Q

Pourquoi plus il y a de GC et plus le Tm est élevé ?

A
  • GC= 3 ponts H
    - AT= 2 ponts H

La liaison GC est plus solide (plus de liens), donc il es plus difficile de séparer les brins et de faire du sb. Donc la Température de fusion ( T° à laquelle 50% sb) est plus haute lorsque la composition en GC est plus élevée.

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21
Q

Pourquoi il est si important d’avoir le Tm optimal pour chaque rx de PCR ?

A
  • T° renaturation trop élevée = nui à l’hybridation donc l’efficacité de la PCR diminue
  • T° de renaturation trop basse = hybridations non spécifique (avec régions non spécifiques) de l’ADN cible. Formation de structures secondaires ou même dimères d’amorces.
  • Tm optimal : ~ Tm -5°C (permet l’amplification de la plupart des produits de PCR)
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22
Q

Quelles sont les 2 familles d’ADN pol thermophiles utilisées en PCR, leur origine et un exemple :

A

1) Famille A
- Origine : bactérienne
- Ex: Taq

2) Famille B
- Origine : archéobactérie
- Ex: Pfu et KOD
- Elles ont étés isolé dans des espèces extrêmophiles.

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23
Q

Quelles sont les 4 caractéristiques principales des polymérales ?

A

1) Thermostabilité : Résistance à la T° (combien de temps avant de se dénaturer ?)
2) Taux de polymérisation : vitesse en Nt/sec
3) Fidélité : taux d’erreur de polymérisation (certaine ont une activité 3’-5’ exonucléase)
4) Processivité : capacité de polymériser sans décrocher. Les pol avec une bonne processivité = des fragments plus long

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24
Q

Comparer les trois polymérase : Taq, Pfu et KOD

A

Voir tableau comparatif dans els notes de cours :)

Trop gros/long à retranscrire héhé :P

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25
Q

Qu’est-ce que l’activité 5’–> 3’ exonucléase ?

A
  • Permet l’élimination de Nt qui se trouve en avant de l’ADN pol. Permet d’enlever certaines amorces si hybridation non-spécifiques (RARE!!!).
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26
Q

Qu’est-ce que l’activité 3’ –> 5’ exonucléase ?

A
  • Proof free !!

- Permet à la pol de revenir en arrière pour effectuer une correction !

27
Q

Qu’est-ce que l’activité terminal transférase ?

A
  • Ne laisse pas d’extrémités franches !

- Les extrémités 3’ générées se terminent par un a

28
Q

Pourquoi utilise t-on d’autres pol même si la KOD ADN polymérase est plus efficace ?

A

Plus efficace = plus coûteux

29
Q

Qu’est-ce que le domaine Sso7d, de quelle espèce a-t-il été isolé ?

A
  • C’est un domaine de liaison à l’ADN qui permet d’augmenter la processivité (permet de polymériser sans décrocher)
    • Permet d’augmenter la stabilité d’interaction entre l’enzyme et le brin d’ADN
    • A été isoler de Sulfolobus solfataricus
30
Q

Donnez un exemple où je déciderais d’ajouter le domaine Sso7d à ma pol ?

A
  • Dans le cadre d’une expérience où j’ai besoin d’amplifier de plus longs fragments.
  • Je vais ajouter le domaine pour augmenter la processivité ( capacité de polymériser sans décrocher) de l’enzyme
31
Q

Dites quelles enzymes vous utiliseriez dans les cas présent :

1) Clonage d’une fragment d’ADN :
2) Déterminer la présence ou l’absence de fragments précis dans un échantillon :

A

1) Clonage d’une fragment d’ADN : utilisation d’une enzyme avec l’activité proof-read (Pfu ou KOD)
2) Déterminer la présence ou l’absence de fragments précis dans un échantillon : Pas besoin de proof read, la Taq peut sufir. On veut seulement déterminer si séquence spécifique est présente, mais sans savoir la séquence précise au complet.

32
Q

Nommez les 4 stratégies générales utilisées pour l’optimisation de la PCR:

A

1) Changement du Tampon
- pH, ions Mg2+ , détergents, BSA, etc.
- Certains additifs ont une certaines logique : nuire à l’hybridation (favorise la dissociation des hybrides db, nuire aux interactio s non spécifiques ou dimères d’amorces)
- Ion Mg2+ : cofacteur, en l’augmentant = augmente la processivité (capacité de polymériser sans décrocher). On en met surtout dans des échantillons sales… Pour chélater les ions !
- BSA : Parfois ça fonctionne, mais on ne sait pas trop pourquoi… Ça cause pas de tort, mais on ne sait pas trop pourquoi ça augmente l’efficacité…

2) Optimisation de la T° de renaturation
- Hot start
- Touch-down
- Gradient

3) Utilisation d’une autre ADN pol
4) Synthèse de nouvelles amorces

33
Q

En quoi consiste l’utilisation d’un gradient de T° pour optimiser la PCR ?

A
  • Permet de trouver la T°m optimale .
  • Utiliser un thermocycleur qui possède un bloc qui est capable de faire varier la T° le long du bloc.
  • Avantage: rapidement trouver les conditions optimales (T°)
  • Faire une préparation mère et faire plusieurs tubes placés à différents endroit, pour voir la renaturation optimale . On teste systématiquement différentes T° de renaturation pour choisir la plus optimale !
34
Q

Expliquez à quoi sert et en quoi consiste la méthode Hot Start :

A
  • Hot start : Prévenir l’activité de l’ADN pol avant le premier cycle ou avant que la T° de dénaturation ne soit atteinte. Ça permet d’éviter les appariement moins spécifiques à plus basse T°.
  • L’idée est de bloquer la pol tant et aussi longtemps qu’on aura pas atteint la T° de 95°C.

1) Séquestrer une composante de la rx.
Ex 1: enzyme fonctionne bien, sauf si on a une plaque de 96 puits
Ex 2: Séquestrer des ions Mg2+)
2) Amorces modifiées en 3’ avec des groupements chimiques thermolabiles, qui sont réversibles à haute T°.
3) ++ utilisée : inactivation de l’ADN pol
- Disponible commercialement ! La pol est déjà couplé avec un Anticorps, ce qui l’empêche de fonctionner avant d’avoir atteint une certaine T°.
- Donc on doit faire un préchauffage plus long pour s’assurer que l’ADN pol est dénaturée (suivre les indications du fabricant)

35
Q

Expliquez à quoi sert et en quoi consiste la méthode Touch-down:

A
  • L’idée est d’Utilisation d’une T° de renaturation beaucoup plus élevée qu’à l’habitude afin de défavoriser l’efficacité du PCR pour favoriser l’hybridation spécifique. Donc en diminuant la T° par la suite, une certaine compétition sera gagnée par la masse de produits spécifiques.
      Étapes : 
  1) Utilisation d'une T° de renaturation beaucoup plus élevée qu'à l'habitude.
  2) Diminution d'environ 1°C par cycle (~15 cycles)
  3) On diminue la T° jusqu'à environ -10°C du Tm, on complète la rx avec ~15 cycle   
        à cette T°.
36
Q

Parlez-moi de l’amplification isothermale Phi29 RCA:

A
  • Permet de répliquer in vitro des plasmides par la méthode de cercle roulant. Matrice circulaire (parfois linéraire).
  • Utilisation d’un polymérase virale (Phi29) d’un bactériphage (fonctionne à T° de 30 °C)
  • Facteur d’amplification très élevé et amplification exponentielle
  • Taux d’erreur faible : >50 fois moins que la Taq
  • L’idée est d’amplifier n’importe quel ADN dans un tube
    Ex: Quand on se retrouve dans un lab plus vieux (au moins 10 ans), qu’on a un projet avec un vieux tube qui contient un clone créer vlà très longtemps… On retrouve un tube sec, on remet un peu d’eau, on veut faire une transformation mais ça ne fonctionne pas (ADN faible ou séché)… On va donc : RCA
  • RCA: Va créer, va amplifier TOUT l’ADN présent dans le tube en faisant des concaténaire en permettant aux amorces aléatoires de se réhébrider –> embranchement = tonne de copies. On peut ensuite couper avec des enzymes de restriction…
  • Super pour amplifier un échantillon faible en ADN
37
Q

Quelle est la particularité de la polymérase du bactériophage Phi29 ?

A

Déplacement de brin grâce aux liens phosphorothioates: Quand la pol va polymériser, elle va déplacer les amorces aléatoires pour continuer la polymérisation à partir du cercle original.

38
Q

Décrivez le mode d’action des liens phosphorothioates:

A
  • La Taq polymérase possède une activité 5’-3’ exonucléase qui lui permet d’enlever ce qui se trouve devant elle en dégradant le liens phosphodiester (le O est reconnu au site catalytique) des Nt.
  • La pol Phi29 elle déplace le brin au lieu de le dégrader grâce aux liens phosphorothioates.
  • La présence de l’atome de soufre (S) empêche d’amener le lien phosphorothioate au site catalytique des nucléases (S>O) et prévient donc la dégradation des amorces !
39
Q

Vrai ou faux :
1) Le polymère formée après l’amplification RCA n’est plus un plasmide.

2) Le polymère formé peut servir pour la PCR, la digestion par enzyme de restriction ou pour la détection/diagnostic.
3) On pourrait essayer de recréer un plasmide avec le polymère en utilisant 1 enzyme de restriction et en le religuant sur lui-même.

A

1) Le polymère formée après l’amplification RCA n’est plus un plasmide.
- Vrai
2) Le polymère formé peut servir pour la PCR, la digestion par enzyme de restriction ou pour la détection/diagnostic.
- Vrai
3) On pourrait essayer de recréer un plasmide avec le polymère en utilisant 1 enzyme de restriction et en le religuant sur lui-même.
- Vrai

40
Q

Expliquez en quoi consiste l’amplification isothermale méthode LAMP (outil de diagnostic rapide)

A
  • Utilisation d’une polymérase de B. stearothermophilus (Bst)
    • Utilisation de 2 amorces internes avec séquences formant une boucle interne
    • Utilisation de 2 amorces externes permettant le déplacement de brin
    • Ajout d’un marquer colorimétrique
    • Permet de faire un amplification exponentielle à des fins de diagnostique à l’aide d’une détection colorimétrique/turbidité
41
Q

Quelles sont les particularité de la polymérase Bst (utilisé dans la méthode LAMP) ?

A
  • Activité optimale ~ 60-65°C
    • Aucune activité exo 5’
    • Activité de déplacement de brin
42
Q

Qu’est-ce que le clonage moléculaire ?

A

C’est l’action d’insérer un fragment d’ADN dans un plasmide afin d’obtenir un grand nombre de copies et de le manipuler génétiquement.

43
Q

Nommez les 6 étapes classiques d’un clonage moléculaire :

A
  1. Digestion de l’ADN cible et du vecteur
    2. Ligation de l’insert et du vecteur
    3. Transformation du vecteur dans E. coli ( ou autre)
    4. Sélection des transformants(matrice sélective , gène ATBr, etc.)
    5. Extraction (pour séquençage)
    6. Diagnostic
44
Q

Quelles sont les 4 caractéristiques utiles d’un vecteur ?

A
  1. Peuvent être introduit dans l’hôte
    2. Peuvent se répliquer dans l’hôte (ORF)
    3. Contient plusieurs sites de restrictions uniques (- important que les 3 autres)
    4. Contient (au moins) un marqueur de sélection ( gène ATBr, couleur , etc.)
45
Q

Vrai ou faux clonage classique “old school” :
1. On utilisait des enzymes de restriction communes à l’insert et au vecteur pour avoir des extrémités cohésives.

  1. Le plus gros désavantage de cette méthode c’est que les extrémités cohésives peuvent se refermer sur elle-même et donc se replier
A
  1. Vrai

2. Vrai

46
Q

Expliquez les 2 grande catégories d’approches de clonage modernes avec la PCR :

A

Approche non-directionnelle :

	- Insert peut s'insérer dans une direction ou l'autre 
		1. Clonage à extrémités franches 
		2. ClonageT/A

Approche directionnelle:
- Sert à insérer un gène dans une orientation bien précise (ex: quand on
s’intéresse à un gène codant pour une protéine)
- Sert à insérer le gène dans le bon orientation de la région codante.
1. PCR mutagénique, enzymes de restriction et PCR fusion)
2. Golden Gate assembly
3. Assemblage de Gibson
4. Assemblage par recombinaison in vivo

47
Q

Approche non-directionnelle : expliquez le clonage à extrémités franches et dites les avantages/désavantages:

A
  • On utilise des bouts francs et une ADN ligase pour insérer un insert dans un vecteur.Avantages:
    1. Simple
    2. Pas besoin de se casser la tête avec des bouts cohésifs
    Désavantages:
    1. Pas directionnel (insert inséré dans n’importe quel sens)
    2. Le vecteur peut se refermer sur lui-même = faux positif (On déphosphorylle les
    bouts en 5’ du vecteur pour empêcher le vecteur de se refermer sur lui-même, mais
    dans ce cas on doit phosphoryler les bouts 5’ des insert après la PCR !)
48
Q

Dans l’approche non-directionnelle (le clonage à extrémités franches) il est possible d’utiliser des vecteurs spécialisés permettant la contre-sélection, expliquez :

A
  • Il est possible d’utiliser un marqueur de contre-sélection digéré envers les vecteur refermés sur eux-mêmes.
  • Si b intègre le vecteur refermé sur lui-même = ccdb exprimé et bloque l’z gyrase = enzyme essentielles pour la bactérie = b meurt
  • Si b intègre vecteur + insert = La présence de l’insert empêche l’expression du ccdb = croissance b
49
Q

Approche non-directionnelle : expliquez le Clonage T/A et dites les avantages/désavantages:

A
  • Utilisation d’un vecteur spécialisé qui fournit des extrémités cohésive en 3’ composées d’un seul T
  • Utilisation d’un insert (produit par PCR) qui a un subit un ajout d’un A en 3’ après la PCR (par une activité terminale transférase)
  • Ligation des extrémités cohésives 3’A et 5’TAvantages:
  1. On peut cloner directement des fragment amplifiés par PCR si on utilise la Taq pol (car activité terminale transférase pour mettre le A en 3’)
  2. Facile et rapideDésavantages:
  3. Appariement par hybridation
  4. Simple, mais non directionnelle (donc produit de PCR s’insère dans un sens ou dans l’autre)
  5. Besoin d’une activité terminale transférase
50
Q

Est-ce qu’on doit déphosphoryler le vecteur avec la méthode de clonage T/A ?

A

NON !

Pas besoin puisque présence d’extrémités cohésives T en 5’, le vecteur ne peut pas se refermer sur lui-même.

51
Q

Approche directionnelle :Expliquez la PCR mutagénique, dites ces avantages et ces désavantages :

A
  • Utiliser des amorces pour amplifier une segment d’ADN précise tout en ajoutant une séquence en 5’ (sera utilisé comme insert)
  • La séquence de l’amorce en 3’ = s’hybride parfaitement avec le segment à amplifier
  • La séquence de l’amorce en 5’ peut inclure pratiquement n’importe quelle séquence (dont des sites de restrictions qui peuvent ensuite être utilisés lors du clonage moléculaire)Avantages:
  • Permet d’inclure des sites de restriction différents (donc empêche le vecteur de se refermer sur lui-même)
  • Permet d’inclure un insert dans l’orientation voulu !
52
Q

Quelle sont les contraintes à respecter lors d’ajout de site de restriction en 5’ de l’amorce dans une PCR mutagénique ?

A
  1. Le site de restriction doit être situé à au moins 6 Nt de l’extrémité 5’ de l’amorce pour être bien reconnu et clivé par l’enzyme
  2. Le site de restriction utilisé ne doit pas se retrouver à l’intérieur de la séquence à amplifier
  3. Le vecteur doit être digéré avec des sites compatibles
  4. Ajouter du foin pour s’Assurer de l’enzyme puisse bien “s’asseoir” sur l’ADN
53
Q

Quelles sont les 4 méthodes d’assemblages moderne (approches directionnelles modernes):

A
  • PCR fusion/ligation
    • Golden Gate
    • Gibson
    • Recombinaison in vivo
54
Q

En quoi consiste le clonage directionnel PCR fusion ?

A
  • Combiner 2 fragments d’ADN par PCR
  • Nécessite 3 réactions de PCR
    1- Produit A : Amorce 1 et 2
    2- Produit B : Amorce 3 et 4
    3- Produit final AB : amorce 1 et 4 et produits d’amplification de la réaction 1 et 2
  • Utiliser des amorces qui contiennent des régions complémentaires afin que les produits d’amplification A et B puissent s’hybrider et donc servir de matrice pour la réaction d’amplification du produit final.
  • Fonctionne bien avec des fragments max de 3kpb (pour le fragment final)
55
Q

En quoi consiste la méthode du Golden Gate assembly ?

A
  • C’est une méthode qui permet d’assembler plus d’une 20aine de fragments simultanément (1 seule étape de ligation)
  • Pas de cicatrices
  • Utile pour l’assemblage de fragments répétés
  • Utilise les enzymes de restriction de type IIS (qui clive hors du site de restriction non palindromique pour savoir l’orientation= laisse un bout cohésif qui ne contient pas de site de restriction). On va donc pouvoir ajouter des Nt compatibles aux bouts cohésifs (NNNN)
  • Les parties cohésives NNNN sont donc conçus pour s’hybrider ensemble.
  • Après la ligation de tous les fragments, on digère avec l’enzyme pour éliminer les vecteurs vides.

P.S. : si les fragments ne possèdent pas le site de restriction de l’enzyme IIS on peut faire une PCR mutagénique pour ajouter le site des restriction non palindromique.

56
Q

En quoi consiste l’assemblage de Gibson ?

A
  • C’est une méthode basée sur l’homologie de séquence qui ne nécessite pas d’enzyme de restriction.
    • Permet d’assembler jusqu’à 6 fragments simultanément (5 ADN + 1 vecteur)
    • Ajout dans les amorces en 5’ l’homologie des séquences
    • Besoin du mélange réactionnel : 5’-exonucléase, ADN polymérase et l’ADN ligase
    Étapes :
    - L’extrémité 5’ est bouffée par la 5’ exonucléase (rx arrête avec la T°)
    - Homologie de séquence = appariement
    - La polymérase va polymériser 5’ –> 3’ jusqu’au bout initialement bouffé par le
    5’exonucléase
    - Ligase celle les bouts
57
Q

Parlez-moi du design des amorces dans la méthode Gibson

A
  • Design d’une amorce FWD : Région d’homologie en 5’ avec la fin du fragment précédent (ajouter la séquence dans la même orientation que la séquence)
  • Design d’une amorce REV : Région d’homologie complémentaire inverse du début de la séquence suivante
58
Q

Parlez-moi des 2 manières de préparer le vecteur dans la méthode de Gibson :

A
  1. Couper le vecteur avec une enzyme de restriction (bout 5’ cohésif, bout 3’ cohésif ou bout blunt). Toujours se souvenir que l’exonucléase 5, bouffe les bouts 5’ donc on ne peut pas se servir de ces couts pour l’homologie !
  2. Linéariser le vecteur avec la PCR (l’amplifier par PCR en concevant des amorces qui vont dans la direction opposée). Les extrémités 5’ vont devenir les nouvelles extrémités.
59
Q

Nommez des avantages de la méthode de Gibson :

A
  1. Efficace
  2. Permet d’assembler jusqu’à 6 fragments simultanément en 1 étape.
  3. Les fragments d’ADN peuvent être double ou simple brin
60
Q

Parlez-moi de la méthode assemblage par recombinaison in vivo :

A
  • Méthode qui utilise un hôte (S. cerevisiae) au lieu d’enzymes purifiées dans un tube
  • Donc on utilise la capacité de recombinaison homologue in vivo de S. cerevisiae
  • On amplifie les fragments d’ADN par PCR et on s’arrange pour ajouter des régions homologues dans les amorces de PCR. Puis on transforme tous ces fragments dans la levure S. cerevisiae. On va fournir un vecteur spécial à la levure, qui contient les séquences qui va permettre de faire la réplication dans la levure, si assemblage de tous les fragments = colonie sur la plaque.
  • On fournit un marqueur de sélection dans le plasmide qui permet de faire la sélection des levures qui on intégrées le plasmide. Ex: His3 qui est un marqueur nutritionnel qui permet à la levure de synthétiser de l’histidine. Donc permet à la levure de pousser sur un milieu sans histidine.
61
Q

Quel sont les avantages majeurs de la méthode d’assemblage in vivo ?

A
  1. Capacité d’assembler de nombreux fragments de très grande taille ! (Gibson a démontré 25 fragments de 25 kpb pour reconstituer un génome complet !)
  2. Peu de manipulation
  3. ADN sb ou db
62
Q

Quel est le désavantage majeur de la méthode d’assemblage in vivo ?

A

Beaucoup de temps d’incubation pour la croissance de la levure

63
Q

Comment choisir entre l’assemblage in vitro ou in vivo ?

A
  • In vitro : plus rapide (1 jour) que la croissance des levures (2-5 jours)
  • In vivo : nécessite moins de manipulations enzymatiques (donc moins $$) et permet d’assembler un grands nombre de fragments beaucoup plus longs.

TSB 400 - Techniques De Biologie Moléculaire (6 decks)

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