3. Analyse de Protéines et Interactions protéines/protéines et prot/ADN Flashcards
Qu’est-ce que l’interactome ?
Ensemble des interactions moléculaires qui se produisent au sein d’une cellule (protéines/protéines, protéines/ADN, etc.)
Définissez ces types d’interaction protéines-protéines:
- Constitutives
- Stables
- Moyennes
- Transitoires
- Instantanés
- Constitutives : prot toujours retrouvées en complexe (ex: hétérodimères)
- Stables : Intercations fortes, mais pas nécessairement constitutives
- Moyennes : Complexes protéiques, etc.
- Transitoires : Hormone-récepteur
- Instantanés: Enzymes-substrats
Décrivez la purification d’un complexe protéique old school :
- Lyse cellulaire
- Extraction
- Précipitation différentielle
- Chromatographie
- Électrophorèse
Nommez les désavantages de la technique de purification d’un complexe protéique old school:
- Ardu
- Besoin de beaucoup de matériel de départ
- Chaque protéine a besoin de sa technique spécifique
- Pas une méthode facile et universelle
Les approches modernes sont basées principalement sur 4 principes, lesquels ?
- L’immunologie
- Étiquettes d’affinité
- Principes physiques complexes
- Approches génétiques
Nommez des approches modernes basées sur l’immunologie .
De quoi dépendent ces techniques ?
- Immunoprécipitation
- Western Blot
- ELISA
- Microscopie
Dépendent de la production d’anticorps spécifiques (polyclonaux et monoclonaux)
Production anticorps polyclonaux vs monoclonaux. Expliquez.
Poly :
- Injection d’un antigène dans un lapin pour créer une immunisation
- Récolte du sang, séparation du sérum
- Récolte de tous les anticorps dans le sérum
- Mettre sérum et antigènes en contact, isolation des anticorps qui reconnaissent l’antigène
- Purification des anticorps spécifiques à l’antigène
Mono :
- Souri mis en contact avec l’antigène spécifique = immunisation
- Isolation de cellules souches de souris avec des cellules de myélome
- Création d’hybridomes (c avec 1 seul cytoplasme et 2 noyaux = les deux capacités, se répliquer comme une cellule tumorale et production anticorps)
- Isoler le mélange et sélection du meilleur anticorps ( moins de risque d’interaction non-spécifique)
PLUS COUTEÛX et PLUS LONG !!
Dites de quelle technique basée sur l’immunologie je parle :
- Utilisation d’un anticorps spécifique qui reconnait une protéine connue, couplé à une matrice solide, pour isoler la protéine d’une solution en contenant plusieurs !
- Immunoprécipitation d’un complexe protéique en ciblant une des composantes du complexe, afin d’identifier les autres membres.
- Immunoprécipitation (IP)
2. Co-immunoprécipitation (co-IP)
Nommez quelques méthodes d’immunoprécipitation :
- De précipitation
- De détection
- Précipitation:
- Billes d’agarose, sépharose puis précipitation
- Billes magnétiques , aimant - Méthodes de détection:
- SDS-Page (bleu de coomassie)
- Western Blot
- Spectrométrie de masse
Quelles sont les étapes générales d’une immunoprécipitation ?
- Récolte et lyse cellulaire
- Incubation de l’extrait avec des billes (billes couplées à l’anticorps spécifique)
- La précipitation des billes (agarose/sépharose poreuses ou magnétiques solides) permet de laver les protéines non-liées
- Les protéines sont éluées pour permettre l’analyse (éluées avec T° 98°C, avec un agent réducteur et détergent SDS-PAGE
- Analyse sur SDS-PAGE
Nommez 3 avantages et 5 inconvénients de l’immunoprécipitation :
Avantages :
- Interactions détectées à partir d’extrait in vivo (cellules)
- Purification spécifique et facile
- Grande sensibilité
Désavantages:
- Besoin d’un anticorps
- Interaction directe ou indirecte (médié par un intermédiaire)
- Interactions > moyennes
- Exposition de l’épitope (dur de détecter les anitcorps monoclonaux
Attention au témoins !
Quel témoin utilise-t-on pour l’immunoprécipitation ?
- Même expérience
- Utilisation de billes sans anticorps
= Permet de détecter si présence d’interactions non-spécifiques.
Qu’est-ce qu’une étiquette d’affinité (tag) ? Comment la créé-t-on ?
C’est une séquence peptidique ajouté à la protéine d’intérêt en C- ou N-terminal.
Création:
- Création d’un gène fusion
- In vitro : par clonage et approche de génie génétique
- In vivo : par recombinaison homologue
Nommez quelques étiquettes fréquemment utilisées :
**Perso je ne vais pas apprendre ça… Mais je l’ai écrit au cas que toi tu voulais :D
- GST, a de l’affinité pour glutathione
- Flag-Tag, a de l’affinité pour un anticorps
- HA-Tag, a de l’affinité pour un anticorps
- Myc-tag, a de l’affinité pour un anticorps
- His-Tag (la seule que je connais :D), a de l’affinité pour le Ni (Nichel) car sa charge positive interragit avec le Nichel (précipitation protéine d’intérêt.
Qu’est-ce que l’essais Pull-down?
Co-précipitation in vivo ou in vitro
(Soit à partir d’extraits ou sur les protéines recombinantes pures)
- Une protéine est fusionnée à une étiquette (GSTou His-tag) immobilisée sur une bille.
- Incubation en présence de l’autre protéine (extrait mixte ou purifiée)
- Plusieurs étapes de « lavage »: pour éliminer les interactions non-spécifiques
- Il faut un contrôle sans étiquette !!!!
Avantages et inconvénients méthode Pull-down
Avantages:
- Universel (ou presque)
- Protocole simple
- Possibilité de déterminer des interactions directes (in vitro avec composants purifiés)
Inconvénients:
- Présence d’une étiquette (risque de dénaturation)
- Requiert la préparation de gènes fusion
- Interactions >moyennes
- Attention au repliement in vitro des protéines recombinantes
- Purifications « sales »
Qu’est-ce que la méthode Tandem Affinity Purification (TAP) ?
- Interaction protéines-protéines
- 2 étiquettes d’affinités avec un site de clivage entre les 2.
- Implique la création d’une protéine fusion portant une étiquette TAP
- Analyse des complexes par électrophorèse, immunobuvardage western ou spectrométrie de masse.
- Essais enzymatique
Qu,est-ce qu’une étiquette TAP ?
L’étiquette TAP contient 3 éléments qui permettent 2 purifications en série:
- ProtéineA (liaison à des billes portant des IgG à leur surface)
- Site de clivage de la protéase TEV = libération des protéines immobilisées sur billes
- Calmoduline binding peptide qui permet la liaison à des billes de calmoduline en présence de calcium. Le calcium permet d’éluer.
Une élution douce avec la méthode TAP permet quoi ?
Beaucoup de flexibilité pour l’analyse qui va suivre après l’élution ! Donc une élution au calcium au lieu d’avec une T° élevée ou un chmt de pH va permettre d’éviter une dénaturation ! Le complexe sera isolé, purifié et propre prêt à l’analyse !
Méthode TAP avantages vs désavantages:
Avantages:
• Universel (ou presque)
• Haut degré de purification
• Possibilité d’élution «douce» des complexes
• Outil puissant de détection de complexes (couplé à la mass spec)
Désavantages:
- Direct ou indirect?
- Présence d’une étiquette(risque de dénaturation)
- Interactions > moyennes
Qu’est-ce que la méthode BioID ?
- Approche basée sur le marquage méthabolique par la biotine
- La protéine appât est fusionnée à BirA qui est une biotine ligase de E.coli (version modifiée de BirA qui peut biotinyler de manière non-spécifique)
- La biotine va être ajoutée à toute prot in vivo proche de l’appât
- Une fois biotinylées, les protéines seront purifiées avec des billes-streptavidines et identifiées par LC-MS/MS
Avantages et inconvénients de la méthode BioID :
Avantages:
- Universel (oupresque)
- In vivo
- Haute sensibilité
- Détection d’interactions transitoires
- Outil puissant de détection de complexes (couplé à la mass spec)
- Fonctionne bien pour les complexes insolubles
Inconvénients: • Détection de proximité – Biologiquement significatif? – Risque de faux-positifs • Présence d’une enzyme sur la protéine appât = risque de dénaturation, de nuire à la structure de l’appât
