3. Analyse de Protéines et Interactions protéines/protéines et prot/ADN

Question 1

Qu’est-ce que l’interactome ?

Answer 1

Ensemble des interactions moléculaires qui se produisent au sein d’une cellule (protéines/protéines, protéines/ADN, etc.)

Question 2

Définissez ces types d’interaction protéines-protéines:

1. Constitutives
2. Stables
3. Moyennes
4. Transitoires
5. Instantanés

Answer 2

1. Constitutives : prot toujours retrouvées en complexe (ex: hétérodimères)
2. Stables : Intercations fortes, mais pas nécessairement constitutives
3. Moyennes : Complexes protéiques, etc.
4. Transitoires : Hormone-récepteur
5. Instantanés: Enzymes-substrats

Question 3

Décrivez la purification d’un complexe protéique old school :

Answer 3

1. Lyse cellulaire
2. Extraction
3. Précipitation différentielle
4. Chromatographie
5. Électrophorèse

Question 4

Nommez les désavantages de la technique de purification d’un complexe protéique old school:

Answer 4

1. Ardu
2. Besoin de beaucoup de matériel de départ
3. Chaque protéine a besoin de sa technique spécifique
4. Pas une méthode facile et universelle

Question 5

Les approches modernes sont basées principalement sur 4 principes, lesquels ?

Answer 5

1. L’immunologie
2. Étiquettes d’affinité
3. Principes physiques complexes
4. Approches génétiques

Question 6

Nommez des approches modernes basées sur l’immunologie .

De quoi dépendent ces techniques ?

Answer 6

1. Immunoprécipitation
2. Western Blot
3. ELISA
4. Microscopie

Dépendent de la production d’anticorps spécifiques (polyclonaux et monoclonaux)

Question 7

Production anticorps polyclonaux vs monoclonaux. Expliquez.

Answer 7

Poly :

• Injection d’un antigène dans un lapin pour créer une immunisation
• Récolte du sang, séparation du sérum
• Récolte de tous les anticorps dans le sérum
• Mettre sérum et antigènes en contact, isolation des anticorps qui reconnaissent l’antigène
• Purification des anticorps spécifiques à l’antigène

Mono :
- Souri mis en contact avec l’antigène spécifique = immunisation
- Isolation de cellules souches de souris avec des cellules de myélome
- Création d’hybridomes (c avec 1 seul cytoplasme et 2 noyaux = les deux capacités, se répliquer comme une cellule tumorale et production anticorps)
- Isoler le mélange et sélection du meilleur anticorps ( moins de risque d’interaction non-spécifique)
PLUS COUTEÛX et PLUS LONG !!

Question 8

Dites de quelle technique basée sur l’immunologie je parle :

1. Utilisation d’un anticorps spécifique qui reconnait une protéine connue, couplé à une matrice solide, pour isoler la protéine d’une solution en contenant plusieurs !
2. Immunoprécipitation d’un complexe protéique en ciblant une des composantes du complexe, afin d’identifier les autres membres.

Answer 8

1. Immunoprécipitation (IP)

2. Co-immunoprécipitation (co-IP)

Question 9

Nommez quelques méthodes d’immunoprécipitation :

1. De précipitation
2. De détection

Answer 9

1. Précipitation:
   - Billes d’agarose, sépharose puis précipitation
   - Billes magnétiques , aimant
2. Méthodes de détection:
   - SDS-Page (bleu de coomassie)
   - Western Blot
   - Spectrométrie de masse

Question 10

Quelles sont les étapes générales d’une immunoprécipitation ?

Answer 10

1. Récolte et lyse cellulaire
2. Incubation de l’extrait avec des billes (billes couplées à l’anticorps spécifique)
3. La précipitation des billes (agarose/sépharose poreuses ou magnétiques solides) permet de laver les protéines non-liées
4. Les protéines sont éluées pour permettre l’analyse (éluées avec T° 98°C, avec un agent réducteur et détergent SDS-PAGE
5. Analyse sur SDS-PAGE

Question 11

Nommez 3 avantages et 5 inconvénients de l’immunoprécipitation :

Answer 11

Avantages :

• Interactions détectées à partir d’extrait in vivo (cellules)
• Purification spécifique et facile
• Grande sensibilité

Désavantages:
- Besoin d’un anticorps
- Interaction directe ou indirecte (médié par un intermédiaire)
- Interactions > moyennes
- Exposition de l’épitope (dur de détecter les anitcorps monoclonaux
Attention au témoins !

Question 12

Quel témoin utilise-t-on pour l’immunoprécipitation ?

Answer 12

• Même expérience
• Utilisation de billes sans anticorps
  = Permet de détecter si présence d’interactions non-spécifiques.

Question 13

Qu’est-ce qu’une étiquette d’affinité (tag) ? Comment la créé-t-on ?

Answer 13

C’est une séquence peptidique ajouté à la protéine d’intérêt en C- ou N-terminal.

Création:

• Création d’un gène fusion
• In vitro : par clonage et approche de génie génétique
• In vivo : par recombinaison homologue

Question 14

Nommez quelques étiquettes fréquemment utilisées :

**Perso je ne vais pas apprendre ça… Mais je l’ai écrit au cas que toi tu voulais :D

Answer 14

1. GST, a de l’affinité pour glutathione
2. Flag-Tag, a de l’affinité pour un anticorps
3. HA-Tag, a de l’affinité pour un anticorps
4. Myc-tag, a de l’affinité pour un anticorps
5. His-Tag (la seule que je connais :D), a de l’affinité pour le Ni (Nichel) car sa charge positive interragit avec le Nichel (précipitation protéine d’intérêt.

Question 15

Qu’est-ce que l’essais Pull-down?

Answer 15

Co-précipitation in vivo ou in vitro
(Soit à partir d’extraits ou sur les protéines recombinantes pures)

• Une protéine est fusionnée à une étiquette (GSTou His-tag) immobilisée sur une bille.
• Incubation en présence de l’autre protéine (extrait mixte ou purifiée)
• Plusieurs étapes de « lavage »: pour éliminer les interactions non-spécifiques
• Il faut un contrôle sans étiquette !!!!

Question 16

Avantages et inconvénients méthode Pull-down

Answer 16

Avantages:

• Universel (ou presque)
• Protocole simple
• Possibilité de déterminer des interactions directes (in vitro avec composants purifiés)

Inconvénients:

• Présence d’une étiquette (risque de dénaturation)
• Requiert la préparation de gènes fusion
• Interactions >moyennes
• Attention au repliement in vitro des protéines recombinantes
• Purifications « sales »

Question 17

Qu’est-ce que la méthode Tandem Affinity Purification (TAP) ?

Answer 17

• Interaction protéines-protéines
• 2 étiquettes d’affinités avec un site de clivage entre les 2.
• Implique la création d’une protéine fusion portant une étiquette TAP
• Analyse des complexes par électrophorèse, immunobuvardage western ou spectrométrie de masse.
• Essais enzymatique

Question 18

Qu,est-ce qu’une étiquette TAP ?

Answer 18

L’étiquette TAP contient 3 éléments qui permettent 2 purifications en série:

1. ProtéineA (liaison à des billes portant des IgG à leur surface)
2. Site de clivage de la protéase TEV = libération des protéines immobilisées sur billes
3. Calmoduline binding peptide qui permet la liaison à des billes de calmoduline en présence de calcium. Le calcium permet d’éluer.

Question 19

Une élution douce avec la méthode TAP permet quoi ?

Answer 19

Beaucoup de flexibilité pour l’analyse qui va suivre après l’élution ! Donc une élution au calcium au lieu d’avec une T° élevée ou un chmt de pH va permettre d’éviter une dénaturation ! Le complexe sera isolé, purifié et propre prêt à l’analyse !

Question 20

Méthode TAP avantages vs désavantages:

Answer 20

Avantages:
• Universel (ou presque)
• Haut degré de purification
• Possibilité d’élution «douce» des complexes
• Outil puissant de détection de complexes (couplé à la mass spec)

Désavantages:

• Direct ou indirect?
• Présence d’une étiquette(risque de dénaturation)
• Interactions > moyennes

Question 21

Qu’est-ce que la méthode BioID ?

Answer 21

• Approche basée sur le marquage méthabolique par la biotine
• La protéine appât est fusionnée à BirA qui est une biotine ligase de E.coli (version modifiée de BirA qui peut biotinyler de manière non-spécifique)
• La biotine va être ajoutée à toute prot in vivo proche de l’appât
• Une fois biotinylées, les protéines seront purifiées avec des billes-streptavidines et identifiées par LC-MS/MS

Question 22

Avantages et inconvénients de la méthode BioID :

Answer 22

Avantages:

• Universel (oupresque)
• In vivo
• Haute sensibilité
• Détection d’interactions transitoires
• Outil puissant de détection de complexes (couplé à la mass spec)
• Fonctionne bien pour les complexes insolubles

Inconvénients:
• Détection de proximité
– Biologiquement significatif? 
– Risque de faux-positifs
• Présence d’une enzyme sur la protéine appât = risque de dénaturation, de nuire à la structure de l’appât