5 Flashcards
Klonlamanın iki önemli işlevi?
1çok miktarda dna molekülü üretimi
2saflaştırma
Ligasyon karışımı istenilen rekombinant moleküle ek olarak
¡ Bağlanmamış
Bağlanmamış (unligate) vektör molekülleri
¡ Bağlanmamış (unligate) DNA fragmanları
¡ Yeni DNA içermeden kendi üzerine halkalanan vektör
molekülleri (self-ligated vector)
¡ Yanlış sokulmuş DNA fragmanlarını taşıyan rekombinant DNA
molekülleri
İçerebilir.
Pek çok bakteri türü, büyüdükleri besiyeri ortamından DNA
moleküllerini alabilme yeteneğine sahiptir. Ancak bu şekilde alınan DNA…
Bu şekilde alınan DNA çoğunlukla yıkılır, fakat nadiren
konakta hayatta kalıp replike olabilir. Eğer bu DNA
molekülü konak tarafından tanınan replikasyon orijinli
bir plazmitse!
Kompetan hücre nedir?
Bu türleri etkili bir şekilde transforme etmek için bakteriler DNA
alma yeteneklerini arttıracak birtakım fiziksel ve/veya kimyasal
muamelelere maruz bırakılmalıdır. Bu muameleyi görenler kompetan hücre.
E. coli hücrelerini kompetan hale getirmek için genellikle, 50
mM CaCl2 kullanılır.
CaCl2 DNA’nın hücre dışına çökmesine sebep olabilir?
¡ Tuz hücre duvarında DNA affinitesini arttıracak fiziksel bir
değişime sebep olabilir?
¡ Daha yeni çalışmalar ise, tuz muamelesinin DNA’yı
bağlayabilecek bir veya daha fazla dış membran proteinin
üretiminin artmasına neden olduğunu önermişlerdir.
CaCl2 DNA’yı hücre içine mi sokuyor?
hayır, Her durumda CaCl2 uygulaması sadece DNA bağlanmasına
etki eder, DNA’nın hücre tarafından alınmasına değil!
CaCl2 sonrasında napıyoruz?
Kompetan hücrelere DNA girişi ısı şoku ile gerçekleşir.
¡ Isı şoku membranın DNA geçirgenliğini değiştiriyor olabilir.
¡ CaCl2 muamelesiyle ısı şoku, DNA’nın hücre içine taşınmasına
yardım eden bir membran proteinin aktivitesini indüklüyor
olabilir.
Kimyasal transformasyonda….., elektroporasyonda…..
Kimyasal transformasyonda ısı şok ile, elektroporasyonda elektrikle.
CaCl2 nasıl DNAyı hücreye yaklaştırıyor olabilir?
Ca+2 iyonlari gibi iyonlar - yüklü DNAyı daha nötr bilr hale getiriyordur belki.
Aynı zamanda hücreler buzdan sıcağa alındığında adezyon bölgesi oluşmuş ve DNA ordan geçiyor olabilir.
Bir genin yapısını bozarak eksperese edilmemesini sağlamak?
insersiyonel inaktivasyon
pBR322 nasıl seçilim yapılır?
tet ve amp ile
önce amp-tet ortamında büyütme
sonra sadece tet ortamında (büyüyenler insertü alamayanlar)
pUc seçilimi?
insertü lacZ genine koydun. Sonuç olarak ampisiline dirençli ve beta-galaktosidaz negatif koloniler oluşur. (pUC ampR geni olduğu için dirençli)
Dizin analizi yöntemleri tarihsel?
Sanger Yöntemi (1975)
¡ Maxam-Gilbert Yöntemi (1976-1977)
¡ Otomatize dizin analizi çalışmalarının başlaması(1981-
1982)
¡ İlk yarı otomatik dizin analiz makinası: California
Institute of Technology (1986)
¡ İlk otomatik dizin analiz Makinası: Applied Biosystems,
Prism 373 (1987)
Maxam-gilbert yöntemi (kimyasal yıkım)
Reaksiyon içeriği:
Dizin analizi yapılacak DNA
Baza özgü değişiklik yapan kimyasallar:
Dimetil Sülfat (G bazı),
Formik asit (G ve A bazları),
Hidrazin (C ve T bazları),
Sodyum Klorür (C bazı)
Piperidin
*mantığı DNAnın baza özgü kesimi
*daha sonra jelde boyutuna göre ayırıyon
Diğer DNA dizin yöntemleri maxam gilbertttan sonra…
DNA sentezine dayanan yöntemler.
